用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、dna 分子、蛋白及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒 性出血热的小核酸分子、DNA分子、蛋白以及应用。
【背景技术】
[0002] 病毒性出血热泛指由数类病毒引起的、常伴以出血症状的一种严重疾病。按照病 原分属四科，即沙粒病毒科(拉沙热、胡宁和普马拉)、布尼亚病毒科(克里米亚-刚果出血 热、裂谷热、汉坦出血热）、线状病毒科(埃博拉和马尔堡）以及黄病毒科(黄热病、登革出血 热、鄂木斯克出血热、基萨那森林病)。
[0003] 以上各种病毒性出血热虽然在病原体、寄生宿主和传播途径上各有差异，但都具 有发热、出血倾向及肾脏损害的主要临床特征，都属于急性病毒性传染病。目前均无特效疗 法,采用对症和支持疗法,纠正水和电解质平衡,必要时补液、输血和抗休克治疗。
[0004] 其中，埃博拉出血热因其病原体是埃博拉病毒，也叫埃博拉病毒病，是目前已知的 毒性最大的病毒性疾病之一，病死率高达50 - 90%。目前已确定了埃博拉病毒的5个亚 型：埃博拉-扎伊尔型（EBO-Zaire，ΖΕΒ0)、埃博拉-苏丹型（EBO-Sudan，SEB0)、埃博拉-莱 斯顿型（EBO-R，REB0)和埃博拉-科特迪瓦型（EBO-CI，ICEB0)，埃博拉-本迪布乌干达型 (EBO-Bundibugyo Uganda，ΒΕΒ0)，其中 ZEBO 致病性最强。
[0005] 埃博拉病毒可以通过接触传播，传播速度很快。患者一旦发病，可在24小时内死 亡。主要症状可表现为高热、头痛、恶心、呕吐、腹泻、体内外大出血、全身酸痛等。它属于生 物安全等级四级（BSL-4)的病毒，具有极高的生物危险性。
[0006] 埃博拉病毒的宿主尚未确定，最初被认为是啮齿类动物，但实验后很快被否认。实 验人员发现，感染病毒后的蝙蝠一般不会死亡，因此推断其传染源为带有病毒的蝙蝠及蝙 蝠的排泄物。但这只是推测，是否为蝙蝠还有待确定。
[0007] 从遗传角度来看，埃博拉病毒属于单股负链RNA病毒，其基因组约19kb，具有7个 基因：NP、vp35、vp40、gp、vp30、vp24 和 L，其中 NP, VP30, VP35 和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶构 成病毒体的中心，即核糖核蛋白复合物，该复合物负责转录和复制。VP40和VP24负责核壳 体的形成，病毒的出芽和包装以及决定宿主范围。在这些编码的蛋白质中，GP表面糖蛋白 可能介导埃博拉病毒和靶细胞的结合和融合，在埃博拉出血热的发病机理中起非常重要的 作用。将GP单独转到人源化细胞或其他几种非人源化细胞中，会导致细胞变圆、脱落，细胞 表面粘附因子下调；将GP转入到人或猪血管中，会增加血管的通透性，从而导致血管出血。
[0008] 但由于从血样中检测特异的抗原或病毒的基因，或通过细胞培养分离或者检测病 毒的IgM和IgG抗体的实验都有严重的生物危害，必须在最大限度地保证生物安全的条件 下才能进行，所以，到目前为止，商业上也没有针对病毒感染建立起特异的诊断方法。
[0009] 在埃博拉出血热的治疗方面，一般的抗病毒药物包括利巴韦林和干扰素都对埃博 拉病毒无效。尽管有实验显示，凝固干扰素在感染埃博拉病毒的猴群中似乎可以起一些作 用，但凝固干扰素在人体的效果如何尚未确定。此外，目前也尚无对人类有效的疫苗，埃博 拉出血热的康复者的血清也没有太大的作用，甚至有可能带来更坏的影响。目前的治疗仍 以支持治疗为主，如使病毒的侵入最小化，或及时补充损失的血小板，平衡电解质，保持血 液中氧元素含量以及对并发症的治疗等。现今唯一的治疗方法为注射NPCl阻碍剂，因埃博 拉病毒需透过NPCl进入细胞核进行自我复制，NPCl蛋白于细胞间进行运输胆固醇，但阻碍 剂会阻挡胆固醇的运输路线造成尼曼匹克症。因此，还需要通过更多更广泛的研究思路来 寻找预防和治疗埃博拉出血热疾病方面的药物。
【发明内容】
[0010] 本发明旨在提供一种用于预防和/或治疗出血热的小核酸分子、DNA分子、蛋白以 及它们在药物筛选中的应用，并提供了一种预防和/或治疗出血热的药物研发的新思路。 [0011] 需要说明的是，本发明是基于【背景技术】部分所提到的各种病毒性出血热所引起的 血管结构和功能异常而导致的渗血、出血这一共同症状的前提下，通过大量研究而得到的 结果。因此，本发明下面所提到的以埃博拉病毒为主要研究对象得到的能够抑制或缓解上 述症状的各种物质也适用于上述其他病毒性出血热。
[0012] 由于血管内皮细胞是埃博拉病毒的主要攻击的对象之一，血管内皮细胞在维持血 管通透性和体液平衡方面发挥着重要作用，在埃博拉病毒感染血管内皮细胞后，通常引起 血管结构和功能的异常，进而导致埃博拉出血热弥漫性血管内凝血（DIC)。由于人脐静脉 (human umbilical vein,HUV)是血管内皮细胞的常用来源，其供源丰富，取材方便，血管条 件优越，混杂其他细胞较少，可获得细胞免疫原性较低的血管内皮细胞，可使实验条件和所 获结果更符合人体情况。因此，本发明在进行血管内皮细胞实验时，选用人脐静脉血管内皮 细胞作为细胞模型来进行研究。
[0013] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的 小核酸分子，该小核酸分子为埃博拉病毒感染细胞差异化表达的微小RNA的抑制物和/或 该微小RNA前体的抑制物。
[0014] 进一步地，上述小核酸分子是序列为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5或者SEQ ID NO. 6的微小RNA及其前体的抑制物。
[0015] 进一步地，上述小核酸分子的序列与SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11或者SEQ ID NO. 12具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的 同源性，更优选地，上述小核酸分子的序列为SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11、或者 SEQ ID NO. 12。
[0016] 根据本发明的另一个方面，提供了一种上述小核酸分子在制备用于预防和/或治 疗鄂木斯克出血热、基萨那森林病、克里米亚出血热、新疆出血热、登革出血热、基孔肯雅 热、黄热病、阿根廷出血热、玻利维亚出血热、拉沙热、流行性出血热或者马尔堡病的药物中 的应用。
[0017] 根据本发明的又一个方面，提供了一种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热 的药物，该药物包括治疗有效量的上述小核酸分子。
[0018] 进一步地，上述药物进一步包括一种或多种用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出 血热有效物质，优选地，上述用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热有效物质选自抗病 毒类药物、免疫提升类药物及皮质激素类药物。
[0019] 根据本发明的一个方面，提供了一种上述小核酸分子在体外抑制埃博拉病毒性出 血热感染引起细胞生长脱落的应用，在细胞感染埃博拉病毒之前或之后，将上述小核酸分 子转染至细胞中。
[0020] 根据本发明的一个方面，提供了一种上述小核酸分子在体外筛选用于预防和/或 治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用，将上述小核酸分子与待测药物进行核酸同源性 比对。
[0021] 根据本发明的又一个方面，提供了一种DNA分子，上述DNA分子在埃博拉病毒感染 细胞中的表达水平被上述一种或多种小核酸分子上调。
[0022] 进一步地，上述DNA分子的序列与SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20、SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 26,SEQ ID NO. 27,SEQ IDN0·28、SEQIDN0·29、SEQIDN0·30、SEQIDN0·31或者SEQIDN0·32具有80%以上的 同源性，优选具有95%以上的同源性，更优选地，上述DNA分子的序列为SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15、SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19、SEQ ID NO. 20,SEQ ID NO. 2USEQ ID NO. 22,SEQ ID NO. 23,SEQ ID NO. 24,SEQ ID NO. 25,SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 或 者 SEQ ID NO. 32。
[0023] 进一步地，上述 DNA 分子为序列为 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 20、 SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 或者 SEQ ID NO. 32,优选序列 为 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 23 或者 SEQ ID NO. 24。
[0024] 根据本发明的又一个方面，提供了一种上述DNA分子在体外筛选用于预防和/或 治疗埃博拉病毒性出血热的药物中的应用。
[0025] 根据本发明的又一个方面，提供了一种上述DNA分子编码的蛋白，上述蛋白的序 列与 SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36、SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38,SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40,SEQ ID NO. 4USEQ ID NO. 42,SEQ ID NO. 43,SEQ ID NO. 44,SEQ ID NO. 45,SEQ ID NO. 46,SEQ ID NO. 47,SEQ ID NO. 48,SEQ ID NO. 49,SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51或者SEQ ID NO. 52具有80%以上的同源性，优选具有95%以上的同 源性，更优选地，上述蛋白的序列为SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35、SEQ ID NO. 36,SEQ ID NO. 37,SEQ ID NO. 38,SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40,SEQ ID NO. 4USEQ ID NO. 42,SEQ ID NO. 43,SEQ ID NO. 44,SEQ ID NO. 45,SEQ ID NO. 46,SEQ ID NO. 47,SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51 或者 SEQ ID NO. 52。
[0026] 进一步地，上述蛋白的序列为 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 40、SEQ IDN0·43、SEQIDN0·44、SEQIDN0·46、SEQIDN0·47或者SEQIDN0·52，优选序列为SEQID NO. 34、SEQ ID NO. 43 或者 SEQ ID NO. 44。
[0027] 根据本发明的又一个方面，提供了一种上述蛋白在体外筛选用于预防和/或治疗 埃博拉病毒性出血热的药物中的应用。
[0028] 根据本发明的再一个方面，提供了一种用于检测埃博拉病毒性出血热的试剂盒， 该试剂盒包括可特异性扩增上述小核酸分子所抑制的微小RNA的引物。
[0029] 进一步地，当微小RNA的序列为SEQ ID NO. 1时，逆转录引物序列为SEQ ID NO. 140 :GTCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCTGCT，荧光实时定量 PCR 所 用到的引物：FP 序列为 SEQ ID NO. 146 :CCGCGCAATGGATTTTT，RP 序列为 SEQ ID NO. 147 : GTGCACGCTCCGAGGT ；
[0030] 当微小RNA的序列为SEQ ID NO. 2时，逆转录引物序列为SEQ ID NO. 141 :G TCGTATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCAAC，荧光实时定量 PCR 所用到 的引物：FP 序列为 SEQ ID NO. 148 :CCGCGCTAGGTAGTTTCCT，RP 序列为 SEQ ID NO. 149 : GTGCACGCTCCGAGGT ；
[0031] 当微小RNA的序列为SEQ ID NO. 3时，逆转录引物序列为SEQ ID NO. 142 :GTCGT ATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCGCCC，荧光实时定量 PCR 所用到的引物：FP 序列为 SEQ ID NO. 150 :TCGCGCAAAAGCTGG，RP 序列为 SEQ ID NO. 151 :GTGCACGCTCCGAGGT ;
[0032] 当微小RNA的序列为SEQ ID NO. 4时，逆转录引物序列为SEQ ID NO. 143 :GTCGT ATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACTAGA，荧光实时定量 PCR 所用到的引物：FP 序列为 SEQ ID NO. 152 :TCGCGCTCGAGGAGC，RP 序列为 SEQ ID NO. 153 :GTGCACGCTCCGAGGT ;
[0033] 当微小RNA的序列为SEQ ID NO. 5时，逆转录引物序列为SEQ ID NO. 144 :GTCGTA TCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC.，荧光实时定量 PCR 所用到的引物：FP 序列为 SEQ ID NO. 154 :TCGCGCTGGCAGTGT，RP 序列为 SEQ ID NO. 155 :GTGCACGCTCCGAGGT ;
[0034] 当微小RNA的序列为SEQ ID NO. 6时，逆转录引物序列为SEQ ID NO. 145 :GTCGT ATCCAGTGCACGCTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTGCTGT，荧光实时定量 PCR 所用到的引物：FP 序列为 SEQ ID NO. 156 :TCGCGCTGCGGG，RP 序列为 SEQ ID NO. 157 :GTGCACGCTCCGAGGT。
[0035] 根据本发明的再一个方面，提供了一种用于检测埃博拉病毒性出血热的试剂盒， 该试剂盒包括可特异性扩增上述DNA分子的引物。
[0036] 进一步地，当DNA分子的序列为SEQ ID NO. 13时，引物的FP序列为SEQ ID NO. 100 :AAGCAGGATCTTCTAAGGTT，RP 序列为 SEQ ID NO. 101 :AGTGTTGTTCTTGGTCTCTC ; 当DNA分子的序列为SEQ ID NO. 14时，引物的FP序列为SEQ ID NO. 102 : GTCACTTGCTTCCTTACTTAG，RP 序列为 SEQ ID NO. 103 :TGAGCCATAACCACAGAG ;当 DNA 分子 的序列为 SEQ ID NO. 15 时，引物的 FP 序列为 SEQ ID NO. 104 :ACCAATCAGTGCTCAGTAT， RP 序列为 SEQ ID NO. 105 :TCAACCTCCACATCTCTATC ;当 DNA 分子的序列为 SEQ ID NO. 16 时，引物的 FP 序列为 SEQ IDN0. 106 :TGGTCATCATCTGCTTGTG，RP 序列为 SEQ ID NO. 107 : TTCCTATTCGGTCACTCTCT ;当DNA分子的序列为SEQ ID NO. 17时，引物的FP序列为SEQ ID NO. 108 :GGTAGAACTGAACAACGATAG，RP 序列为 SEQ ID NO. 109 :CAGCAATGGTATAGCAACTT ; 当DNA分子的序列为SEQ ID NO. 18时，引物的FP序列为SEQ ID NO. 110 : CGACGAACAGTAGACAGTATT，RP 序列为 SEQ ID NO. Ill :CAGCAATTCCATCTTCATCACT ;当 DNA 分 子的序列为 SEQ ID NO. 19 时，引物的 FP 序列为 S