一种水稻柱头特异强启动子OsSti1的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻 柱头特异表达启动子OsStil及其应用。
【背景技术】
[0002] 基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制，也是在多阶 段水平来实现的。尽管基因表达在高等生物中是多级调控系统，但是转录水平上的调控是 最关键的环节。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，是众多转录因子及RNA聚合 酶的最终作用靶标，因此，深入研宄启动子的结构、功能和作用模式等具有重大意义（Xu et al.,2011 ；yamamoto et al. , 2011)〇
[0003] 通过分子生物学以及基因工程的手段去研宄和改良作物在农业生产中具有很 好的应用前景（林拥军，2001)。但是在其广泛运用的过程中也逐渐暴露了一些问题，由 于组成型启动子会使驱动的目的基因在受体植物各组织中持续而恒定的表达，所以有时 会带来一些负面效应，如增加代谢负担以及一些食品安全性方面的担忧等等（Conner et al.，2003 ;Kuiper et al.，2001)。为此，随着植物基因工程的发展，人们寻找更为有效的组 织、器官特异性表达启动子来代替组成型表达启动子，以更好地调控目的基因的表达。在组 织特异型启动子调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，并常常表 现出发育调节的特性。目前，组织器官特异启动子的研宄已经取得了很大的进展。
[0004] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亦是禾本科作物功能基因组学研宄的模式 植物（Zhang，2007)，启动子是精确调控基因表达的"开关"。在过去的几年里，尽管克隆了 一些组织特异表达启动子，但是这些组织特异表达的调控机理仍然很不清楚，用于作物遗 传改良的高丰度表达特异启动子仍然较少。因此对水稻组织器官特异表达启动子的分离、 克隆及深入研宄，可以指导转基因育种，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类的 生产生活服务。
[0005] 但是目前现有的获取启动子的方法都或多或少存在其自身的问题。而且，从目前 的现有相关报道来看，现有方式所获得的启动子还不能够很好地满足人们对特异表达启动 子的需求。
[0006] 而且，对于一些特殊植物部位，比如，柱头，目前还没有相于这些部位的特异性强 启动子的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种驱动外源基因在水稻柱头中特异性表达的启动子、获得 含有该启动子序列的表达盒以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的"植物"是指单子 叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0008] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种水稻柱头特异表达启动子OsSti 1，其 特征在于，包含：
[0009] (a) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列；或者
[0010] (b)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0011] (C)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0012] (d) SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具有 启动子功能的核苷酸序列；或者
[0013] (e)与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有启动子功 能的核苷酸序列；或者
[0014] (f)在严格条件下与SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的 核苷酸序列；
[0015] (g) SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列；或者
[0016] (h)与SEQ ID NO: 2中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的且具有启动子功 能的核苷酸序列；或者
[0017] (i)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0018] (j)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的且 具有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0019] (k)在SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的且具 有启动子功能的核苷酸序列；或者
[0020] (1)在严格条件下与SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列杂交且具有启动子功能的 核苷酸序列。
[0021] 序列表中SEQ ID No: 1和2所示的DNA序列为从日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)扩增并提取出的水稻柱头强表达启动子，本文中称为OsStil或启动子 OsStil。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)基 因上游包括转录起始位点在内的1906bp的DNA序列，具有驱动目标基因水稻柱头特异性表 达的功能，该启动子可以在水稻苗期即发挥其作用，因此本发明的发明人分离克隆、并鉴定 了该DNA序列的功能。
[0022] 另一方面，本发明提供一组扩增上述水稻柱头特异表达启动子OsStil的全长或 其任意片段的引物对。
[0023] 另一方面，本发明还提供一种包含上述水稻柱头特异表达启动子的表达盒。
[0024] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的水 稻柱头特异表达启动子OsStil，在所述重组表达载体中，所述水稻柱头特异表达启动子 OsStil连接于待表达的基因序列的上游。优选的，所述待表达的基因为Gus基因，该重组表 达载体为将SEQ ID No: 1所示的序列即OsSti或启动子OsSti构建于pCAMBIA1391中得到 的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-〇sSti。或者待表达基因可以为任何水稻柱头特 异表达基因，该基因在水稻柱头中表达能够改善水稻的性状。
[0025] 再一方面，本发明提供上述水稻柱头特异表达启动子OsStil在培育转基因植物 中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述启动子连接于载体的待表达的基因序列上游 (例如，将所述启动子序列插入目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表达 载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0026] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如 水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0027] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，SEQ ID No :2中的序列为去除了 SEQ ID No :1中开头的22bp以及结尾的22bp后的序列，为获自日本晴水稻中的DNA序列。SEQ ID No :1中开头的22bp为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列；SEQ ID No :1中结 尾的22bp为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相 应序列互补）。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以 指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的 基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。
[0028] 综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻OsStil基因上游包括 转录起始位点在内的1906bp的DNA序列，并将其命名为启动子OsSti。将该序列经酶切后 连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用 该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105,然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到 转基因水稻植株。
[0029] 本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。 并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，可驱 动靶标基因在水稻柱头中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物柱头中的表达量，增 加转基因的效果。但是不会在植物的其他部位表达，因而不会增加植物的代谢负担。
[0030] 技术效果
[0031] 本发明所克隆的水稻启动子OsSti能够调控基因在植株柱头中集中表达，在实际 应用中具有显著价值。这对于水稻生殖发育分子机制的研宄以及应用具有重要的理论和现 实意义。而且，由于其表达集中在柱头中，可以用于培育具有更好生殖性能的基因，改善植 物的繁殖特性。
【附图说明】
[0032] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0033] 图1为将OsStil启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A 为PCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-〇sStil示意图，其中示出了利用OsStil 启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；
[0034] 图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；
[0035] 图3为12周苗龄的OsStil::⑶S转基因植株组织染色图（标尺=2. 5mm)。
【具体实施方式】
[0036] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅 用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0037] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药 材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0038] 含有酶切位点的OsStil启动子的获得
[0039] 步骤1、引物的设计
[0040] 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L