用于表达猪流行性腹泻蛋白中m蛋白、n蛋白和s1蛋白的重组质粒及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N 蛋白和Sl蛋白的重组质粒及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED)首次报道于英国，随后比利时， 德国，加拿大，日本，瑞士等多个国家相继报道，我国于1976年发现此病并陆续报道。猪流 行性腹泻（PED)是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起 的，以猪呕吐，严重腹泻脱水为主要临床症状特征的高度接触性传染病。不同年龄和不同品 种的猪均易感，哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率可达100%，死亡率高达95%以上。近 年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋势，危害比较严重，给养猪业带来巨大经济损失，已成 为中国甚至世界最常见的猪腹泻传染病之一。
[0003] PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科冠状病毒属，其基因组为不分节段的单股正链 RNA，基因组全长约28033bp，编码的结构蛋白主要有纤突（spike)蛋白（即S蛋白），囊膜 (Membrane)蛋白（即M蛋白），核衣壳（nucleocapsid)蛋白（即N蛋白）。PEDV S蛋白可 以被划分为2个功能区即Sl (第1-789位氨基酸）和S2 (第790-1383位氨基酸），其中Sl 区包含了病毒主要的中和表位和受体结合域。
[0004] 2A肽是近年使用较多的一种构建多基因载体的工具，与其它多基因构建策略相 比，2A肽片段小，能自动切割连接的上下游蛋白，并且规避了多基因表达时蛋白活性不高或 下游基因表达量低等缺点，具备明显的优势，是目前较为理想的多基因表达策略。2A肽最初 于1991年被Ryan及其同事在口蹄疫病毒（FMDV)中鉴定得到，可以自裂解为小片段肽，属 于小RNA病毒属小核糖核酸病毒。2A肽平均长度为18-22氨基酸（AA)。2A代表小RNA病 毒多蛋白中的一段特定区域，源于研宄者所参用的学术命名系统。2A肽可以在自己的C-端 自动裂解，N-端被3C/3CD蛋白酶裂解或从上游壳蛋白ID处起修整的一小段肽。2A肽在多 基因共表达中应用广泛，通过2A肽连接从海洋细菌中获取的胡萝卜素4,4'_氧合酶以及3， 3'-羟化酶，可赋予本不能合成酮类胡萝卜素的高等植物（如西红柿和烟草等）生产虾青 素以及斑蝥素的能力。在转基因动物领域，4个复杂的⑶3蛋白（⑶3 ε，γ，δ，ζ )基因通 过2Α肽连接构建逆转录病毒载体后转染CD3缺陷型小鼠骨髓细胞，可活化T细胞，刺激其 功能发挥。2Α肽连接两个荧光报告基因转染小鼠受精卵，可实现小鼠胚胎期、成年后稳定表 达两种荧光蛋白并将该基因稳定遗传给后代。
[0005] 核酸疫苗是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接 注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反 应。核酸疫苗与其他疫苗相比，具有无可比拟的优点：如生产成本低，易于构建适于大批量 生产，可以根据需要随时进行更新，化学性质稳定，保存和运输方便，不存在减毒疫苗毒力 回升的危险；选择抗原决定簇的自由空间比较大，可以同时构建编码不同蛋白质的重组质 粒同时预防多种疾病，为制备联合疫苗方面提供了广阔空间。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种诱导产生针对PEDV特异性抗体的能力强、表达能力 强的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组质粒及其构建方法和应 用。
[0007] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0008] 一种用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组质粒，所述重 组质粒携带有：
[0009] 载体质粒；
[0010] 猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因、Sl蛋白编码基因；及
[0011] 连接肽，所述M蛋白编码基因和N蛋白编码基因通过连接肽连接，所述N蛋白编码 基因和Sl蛋白编码基因通过连接肽连接。
[0012] 本发明中，优选的方案为所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株， GeneBank公布的编号为AF353511。
[0013] 本发明中，优选的方案为所述载体质粒为PVAXl载体质粒，所述连接肽为2A肽。
[0014] 本发明中，优选的方案为该重组质粒为PVAX1-M-2A-N-2A-S1，其中PVAXl为载体 质粒，2A为连接M和N、N和Sl的连接肽2A，M、N和Sl分别为猪流行性腹泻病毒中表达M 蛋白编码基因、N蛋白编码基因和Sl蛋白编码基因。
[0015] 本发明中，优选的方案为所述重组质粒中的M-2A段之间包含一个Furin蛋白酶酶 切位点，所述重组质粒中的N-2A段之间包含一个Furin蛋白酶酶切位点。
[0016] 本发明还提供该用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组 质粒的构建方法，包括如下步骤：
[0017] a、制备含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列的质粒；
[0018] b、制备含猪流行性腹泻病毒中的Sl蛋白编码基因序列的质粒；
[0019] C、将a步骤得到的含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序 列的质粒和步骤b得到的含猪流行性腹泻病毒中的Sl蛋白编码基因序列的质粒双酶切，然 后进行连接反应，得到产品。
[0020] 发明中，优选的方案为：
[0021] 所述a步骤中的含猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因序列 的质粒为含M_2A_N_2A基因序列的质粒，所述含M_2A_N_2A基因序列的质粒的制备方法包 括如下步骤：合成BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列，然后将得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI 基因序列与载体质粒连接，得到含M-2A-N-2A基因序列的质粒；
[0022] 所述b步骤包括如下步骤：以Sl蛋白编码基因序列为模板进行PCR扩增，得到 NotI-Sl-XhoI序列，将NotI-Sl-XhoI序列与载体质粒连接，得到含Sl蛋白编码基因序列的 质粒。
[0023] 本发明中，进一步优选的方案为所述a步骤中含M-2A-N-2A基因序列的质粒为 PVAX1-M-2A-N-2A质粒，制备PVAX1-M-2A-N-2A质粒的方法包括如下步骤：
[0024] 合成BamHI_M_2A_N _2A_NotI基因序列：在M蛋白编码基因肖U加入BamHI酶切位 点和KOZAK序列，在N蛋白编码基因前加入KOZAK序列，利用2A肽将M蛋白编码基因和N 蛋白编码基因连接起来，然后在N蛋白编码基因的尾端连接上2A肽，然后在得到的片段 后加入NotI酶切位点，去除M蛋白编码基因和N蛋白编码基因序列的终止密码子，得到 BamHI-M-2A-N-2A-NotI 基因序列；
[0025] 将得到的BamHI-M-2A-N-2A-NotI基因序列与puc57载体质粒连接，得到 puc57-M-2A-N-2A 质粒；
[0026] 将得到含M-2A-N-2A基因序列的质粒、PVAXl载体质粒双酶切，进行连接反应，得 到 PVAX1-M-2A-N-2A 质粒。
[0027] 本发明中，进一步优选的方案为在M-2A段之间加入一个Furin蛋白酶酶切位点， 在N-2A段之间加入一个Furin蛋白酶酶切位点。
[0028] 本发明中，进一步优选的方案为所述b步骤中含Sl蛋白编码基因序列的质粒为 PMD18-T-S1质粒，制备pMD18-T-Sl质粒的方法包括如下步骤：
[0029] 以Sl基因的核酸序列为模板，以上下游引物进行PCR扩增，其中：
[0030] 上游引物：ATAAGAATGCGGCCGCATGAGGTCTTTAAITTAC (NotI);
[0031] 下游引物：CCGCTCGAGAATACTCATACTAAAGTT (XhoI);
[0032] 其中GCGGCCGC为NotI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点；
[0033] 将扩增得到的Sl基因序列与pMD18-T-Simple载体质粒连接，得到pMD18-T-Sl质 粒。
[0034] 本发明的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组质粒，可 用于制备猪流行性腹泻核酸疫苗。如，将本发明的重组质粒转染293T细胞，该重组质粒便 会在293T细胞中表达M蛋白、N蛋白和Sl蛋白。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0036] 1、本发明选取表达基因为完整的M蛋白编码基因，N蛋白编码基因，Sl蛋白编码 基因，完整的包含了线性抗原表位和中和表位，因此诱导产生针对PEDV特异性抗体的能力 强；
[0037] 2、本发明选取2A肽作为连接表达蛋白的连接肽（Linker)，2A肽序列短，具有高裂 解活性，能够实现编码基因与连接肽直接达到良好的连接；
[0038] 3、M-2A段之间、N-2A段之间包含一个Furin蛋白酶裂解位点（-RAKR)，可以保证 蛋白在没有残留氨基酸的情况下表达，保证了蛋白的活性和空间结构的正确；
[0039] 4、本发明选取PVAXl作为表达载体，它能使重组蛋白在哺乳动物细胞中高效的表 达。
[0040] 下面结合附图及【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
【附图说明】
[0041] 图1是实施例1的用于表达猪流彳丁性腹彳与蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组 质粒的构建示意图；
[0042] 图2是实施例1的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组 质粒双酶切结果的电泳图；
[0043] 图3是实施例1的用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组 质粒的PCR扩增基因的电泳图；
[0044] 图4是实施例1的间接免疫荧光法测定PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒转染293T细胞 后N蛋白的表达图，其中一抗采用N蛋白单克隆抗体，二抗采用绿色荧光二抗；
[0045] 其中，图 2 中，M、10KB 核酸 Marker ;1、PVAX1-M-2A-N-2A-S1 质粒；2、利用 NotI/ XhoI对PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒进行双酶切后的质粒；
[0046] 图3中，M、5KB核酸Marker ;1、PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒中扩增的M蛋白编码基 因；2、PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒中扩增的N蛋白编码基因；3、PVAX1-M-2A-N-2A-S1质粒中 扩增的Sl蛋白编码基因。
【具体实施方式】
[0047] 实施例1
[0048] 一种用于表达猪流行性腹泻蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组质粒，所述 重组质粒携带有：载体质粒；猪流行性腹泻病毒中的M蛋白编码基因、N蛋白编码基因 、Sl 蛋白编码基因；及连接肽，所述M蛋白编码基因和N蛋白编码基因通过连接肽连接，所述 N蛋白编码基因和Sl蛋白编码基因通过连接肽连接；所述连接肽为2A肽；该重组质粒为 PVAX1-M-2A-N-2A-S1，其中PVAXl为载体质粒，2A为连接M和N、N和Sl的连接肽2A，M、N和 Sl分别为猪流行性腹泻病毒中表达M蛋白编码基因、N蛋白编码基因和Sl蛋白编码基因； 所述猪流行性腹泻病毒为猪流行性腹泻病毒CV777株，GeneBank公布的编号为AF353511。
[0049] 构建本实施例的用于表达猪流彳丁性腹彳与蛋白中M蛋白、N蛋白和Sl蛋白的重组质 粒，所