一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于细菌耐药性测定的培养基，尤其涉及一种用于乳酸菌耐药性 测定的通用培养基。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌（lactic acid bacteria)是一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的 通称，主要为乳杆菌属（Lactobacillus)、双歧杆菌属（Bifidobacterium)和链球菌属 (Streptococcus)。乳酸菌为益生菌，在食品和医药工业中占据越来越重要的地位，然而，随 着抗生素的广泛使用，使乳酸菌对多种类型的抗生素产生不同程度的耐药性（健康人体及 保健品中乳酸菌和双歧杆菌的抗药性分析，中国食品学报，2009年，第9卷第6期），另一方 面，由于目前在构建乳酸菌的基因克隆与表达系统大都采用以抗生素抗性基因作为选择标 记，存在抗药性基因转移和扩散的可能性，使得乳酸菌的生物安全性问题引起广泛重视。因 此，测定乳酸菌的耐药性对于保证其安全性乃至保障人类健康具有重要现实意义。
[0003] 目前医学领域测定致病菌，对不同抗生素的敏感性，已形成一套完善的实验方 法，如美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS)，推荐的"抗菌药物敏感性试验执行标 准"（Performance standards for antimicrobial susceptibility testing)。我国医学 微生物实验室采用这一标准，目的在于通过实验筛选出针对目标致病菌敏感的抗生素种类 及最小抑制量，从而用于治疗。然而，对于细菌耐药性试验，由于没有相应的方法标准，通常 情况下参考上述标准，其中的药敏纸片琼脂扩散法（K-B法），就是耐药性试验常采用方法 之一。但就乳酸菌而言，由于乳酸菌对营养因子特殊的需求，该标准所推荐的培养基，不能 满足对不同菌属的乳酸菌同时测定耐药性的需求。
[0004] 乳酸囷主要包括乳杆囷属、双歧杆囷属和链球囷属，其中乳杆囷属、双歧杆囷属需 在厌氧环境下生长，而链球菌则在需氧环境下生长，除此之外，这三个不同属的细菌，对营 养的需求也不同。目前对乳酸杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌，这三种菌属的培养通常使用 不同的培养基，如用于乳酸杆菌培养的乳酸杆菌琼脂培养基（GB 5413. 14、GB 5413. 15、GB 5413. 16、GB 5413. 17、GB 5413. 19)、MRS 培养基（GB 4789. 35)等；用于双歧杆菌培养的 双歧杆菌培养基（GB 4789. 34)、改良MRS(添加了抑制乳杆菌属生长的莫匹罗星锂盐，GB 4789. 35);用于嗜热链球菌培养的MC培养基（GB 4789. 35)、M17培养基等，换言之，目前的 除能同时支持乳酸杆菌和双歧杆菌生长的培养基外，尚没有能够支持包括乳酸杆菌、双歧 杆菌和嗜热链球菌三种菌生长的通用培养基。
[0005] 对乳酸菌的耐药性测定只能使用不同培养基，乳杆菌属、双歧杆菌属耐药性测定 以MRS培养基为主，对链球菌属则采用M17培养基或者其他培养基，如此一来，不仅给实验 人员带来不便，而且不便于室内和室间结果比较，测定方法难以统一规范，并且检测成本比 较高。如果能有一种培养基用于乳酸菌中不同属细菌耐药性测定，不仅提高检测效率，还将 为耐药性测定结果的准确性提供了保证。
[0006] 综上所述，目前使用没有一种培养基适用于三种不同类型乳酸菌耐药性测定，其 技术瓶颈在于：如何选择和优化出一组促生长因子，以组合成一种可以满足三种不同类型 乳酸菌较好生长的培养基，同时，所添加成分不能对各类试验抗生素产生影响，造成结果偏 差。
【发明内容】
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基。已解决现 有技术中没有能同时用于乳杆菌属、双歧杆菌属和链球菌属三种菌属的乳酸菌耐药性测试 的培养基。
[0008] -种用于乳酸菌耐药性测定的通用培养基，其中，每1000 mL的培养基包括：蛋白 胨7~15g，牛肉浸粉3~7g，酵母粉2~4g，葡萄糖15~25g，抗坏血酸棕榈酸醋0. 8~ I. 2g，维生素 B6为2. 6mg，半胱氨酸盐酸盐0. 5~lg，泊洛沙姆I. 0~2. 0g，硫酸镁0. 1~ 0· 3g，MnSO4. 4H20 0· 05g，β -甘油磷酸二钠15~25g，琼脂15~20g，余量为水，pH为 6. 2±0. 2。
[0009] 在一些实施例中，优选为，所述蛋白胨为胰酪胨、大豆胨、细菌蛋白胨或胰酪胨和 大豆胨的混合物。
[0010] 在一些实施例中，优选为，所述维生素 B6为吡哆醇、盐酸吡哆醛或吡哆胺。
[0011] 在一些实施例中，优选为，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
[0012] 在一些实施例中，优选为，所述蛋白胨为胰酪胨5g和大豆胨5g ;所述牛肉浸粉为 5g，所述酵母粉为3g，所述葡萄糖为20g，所述抗坏血酸棕榈酸酯为lg，所述维生素 B6为 盐酸吡哆醛，所述半胱氨酸盐酸盐为0. 5g，所述泊洛沙姆为I. 2g，所述硫酸镁为0. 2g，所述 β -甘油磷酸二钠为19g，所述琼脂为13g。
[0013] 本发明的另一个目的在于提供一种使用上述通用培养基测定乳酸菌对抗生素耐 药性的方法。具体如下：
[0014] 一种用于测定乳酸菌对抗生素耐药性实验的方法，包括如下步骤：
[0015] 1)平板制备：称取上述培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热至完全溶 解，调节pH至6. 2±0. 2,高压灭菌后，待冷却至45°C~55°C，无菌操作倒平板，备用；
[0016] 2)受试菌和标准对照菌的活化与培养：受试菌与标准对照菌分别在各自最适 温度下活化2~3代，分别以0. 5~1. 5 %接种量接种液体培养基，在最适温度下厌氧 或好氧培养12h左右，采用标准比浊溶液测定菌液的OD值，使菌液浓度在I. 5X IO8~ 3. 0X 108cfu/mL 范围；
[0017] 3)接种：分别吸取受试菌与标准对照菌0. lmL，接种于所述步骤1制备的培养基 上，涂布均匀，放置7~15min，使培养基表面干燥；
[0018] 4)药敏纸片贴放及培养：将标准药敏纸片贴放所述步骤1制备的固体培养基表 面，每皿4片，纸片外沿距平皿外沿15~20mm，纸片间距20mm，然后将平皿倒置在培养箱或 充N 2的厌氧罐中，于最适温度下培养18~20h，对生长缓慢者培养48h ;
[0019] 5)结果分析：测量抑菌圈宽度并判断受试菌对抗生素的敏感性测量受试菌与标 准对照菌的抑菌圈宽度，判断受试菌抗生素的敏感性结果。
[0020] 如上所述的方法，优选地，所述受试菌包括乳杆菌、双歧杆菌和/或嗜热链球菌。
[0021] 如上所述的方法，优选地，所述标准对照菌为金黄色葡萄球菌。
[0022] 如上所述的方法，优选地，所述最适合温度为36°C ±1°C。
[0023] 如上所述的方法，优选地，所述判断的标准为：当受试菌的抑菌圈宽度大于或等于 标准对照菌的抑菌圈宽度，或者前者小于后者，但两者之差小于3_判为敏感；当受试菌的 抑菌圈宽度大于3mm，但小于标准对照的抑菌圈宽度，且二者之差大于3mm为中度敏感；当 抑菌圈的宽度小于或等于3mm，为耐药。
[0024] 本发明的培养基可用于乳酸菌中三种不同类型菌种同时生长，培养基的成分对各 类试验抗生素不会产生影响，采用本发明的培养基，通过各类抗生素对乳酸菌耐药性测试， 可作为乳酸菌耐药性测定的通用培养基使用，大大降低了检测成本，并且减少操作步骤，降 低工作人员的劳动强度。
[0025] 本发明的培养基用于乳酸菌的耐药性测定，具有支持乳酸菌生长的包容性强、灵 敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合医学临床微生物检验、食品安全微生物检测、 环境保护等领域，有广泛的应用前景，国内外没有同类产品。
[0026] 本发明培养基与现有培养基相比，具有较强的通用性和专用性，更易于用于测定 乳酸菌的耐药性。
【具体实施方式】
[0027] 本发明在培养基中添加了蛋白胨为乳酸菌的生长提供充足氮源，牛肉浸出粉补充 蛋白胨的功效，酵母粉为乳酸菌生长提供了促进生长和平衡代谢的B族维生素及微量元 素，葡萄糖为细菌生长提供碳源。
[0028] 本发明在培养基中添加了抗坏血酸棕榈酸酯，为刺激乳酸杆菌生长提供了 Vc。
[0029] 本发明在培养基中添加了泊洛沙姆（商品名普流尼克），起增溶作用及利于代谢 物质传输，优选泊洛沙姆188。
[0030] 本发明在配置培养基时，pH为6. 2±0. 2是指pH的范围在6. 0到6. 4之间