一种基于量子点荧光共振能量转移检测基因甲基化程度的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于检测基因甲基化领域，特别涉及一种基于量子点荧光共振能量转移检 测基因甲基化程度的方法。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是构成表观遗传学的重要组成部分和主要研宄内容。通常，甲基化指 在CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。在人类DNA中，可被甲基化的CpG二核苷酸并非 随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组某些区域中，通常是基因的启动子区域，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛（CpG Islands)〇
[0003] 随着DNA甲基化研宄的不断深入，其检测方法也层出不穷。一般而言，检测DNA 甲基化的方法可以分为两类，（1)以亚硫酸氢盐修饰的DNA为基础并在此基础上发展出来 的各种方法。（2)以甲基化敏感限制性内切酶消化为基础的研宄方法。第一种方法研宄的 很多，能够达到定性以及定量的检测甲基化水平。常用的有甲基化特异性的PCR(MS-PCR)， 定量甲基化特异性的PCR(qMS-PCR)，高分辨熔解曲线分析（MS-HRM)，甲基化敏感性单核 苷酸引物延伸法（Ms-SNuPE)，结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA)，荧光定量法 (MethyLight)等。这些方法都会经过亚硫酸氢盐处理这一步，从而实现定量检测DNA甲基 化。然而，这些方法有着不可避免的劣势，比如高费用，操作费时费力，专业的仪器和专业的 操作，掺入放射性元素等。焦磷酸测序是一种实时的，低消费，高通量的定量检测甲基化的 方法，但由于酶的不稳定性导致检测的DNA片段长度受限。
[0004] 以甲基化敏感限制性内切酶消化为基础的研宄方法需要DNA样本在进行PCR扩增 之前进行限制性内切酶酶切操作。甲基化敏感限制性内切酶能够识别特定的位点区域，对 非甲基化部分可以切割，然而对甲基化部分无法切割，通过对扩增片段的比较，从而能够区 分甲基化和非甲基化位点，明确甲基化状态。这种方法操作简单，消费较低，并能灵敏的检 测甲基化，然而存在很难进行定量分析的缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于量子点荧光共振能量转移检测基因 甲基化程度的方法，该方法操作简便，费用低廉，灵敏度高，可以实现高通量的定性及定量 检测甲基化水平，有着较强的通用性，有很好的应用前景。
[0006] 本发明的一种基于量子点荧光共振能量转移检测基因甲基化程度的方法，包括：
[0007] (1)取三辛基氧化磷TOPO包裹的CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳结构量子点QDs稀释 于正己烷溶液；在超声条件下，逐滴加入巯基乙胺Cys溶液；超声后，量子点转入水层，弃去 有机层，在水层中加入丙酮，离心沉淀后，将得到的QDs溶于Milli -Q超纯水中，制备得到 Cys包裹的水溶性CdSe/CdS/ZnS QDs量子点；
[0008] (2)分离提取DNA，检测浓度；取基因 DNA样本，加入HpaII甲基化敏感限制性内切 酶、NEBuffer和超纯水，作为实验组；再取基因 DNA样本与NEBuffer和超纯水混合，作为对 照组；两组DNA样本37~38°C过夜处理，加热使酶失活；
[0009] (3)针对PCDHGB6、H0XA9和RASSF1A基因设计引物，序列至少包含2个CCGG ; [0010] ⑷将步骤⑵中的两组DNA样本经过PCR扩增引入量子点荧光共振能量转移 FRET中能量受体Alexa Fluor-647(A647)，取部分PCR产物用于凝胶电泳成像；剩余PCR产 物加入SAP酶和SAP缓冲液，经过35~40 °C处理1~2h，加热使酶失活；SAP处理后，取步 骤（1)中的量子点溶于HEPES缓冲液进行稀释，然后取SAP处理的PCR产物与稀释后的量 子点混合，置于96孔板中孵育，使用荧光光谱仪检测FRET，计算甲基化程度。
[0011] 所述步骤（1)中的CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳结构量子点QDs稀释于正己烷溶液 后的浓度为KT 6M ;巯基乙胺Cys溶液的浓度为20mg/mL。
[0012] 所述步骤⑵中的基因 DNA样本与HpaII的比例为IOng: IU ;与NEBuffer的比例 为 IOOng:1 μ L。
[0013] 所述步骤（2)中的加热温度为85°C，加热时间为15min。
[0014] 所述步骤（3)中的PCDHGB6的上游引物为GATGTACACCTGCATTTTCG，下游引 物为 CGTTCGCTCGGGTTCTCGCT ;H0XA9 的上游引物为 CCAACGGGTGAGAATAAAC，下游引物 为 AAAAACTACAAGTGGCATGA ;RASSF1A 的上游引物为 AAGATCACGGTCCAGCCTC，下游引物为 CTTCGTCCCCTCCTCACAC 〇
[0015] 所述步骤（4)中的PCR反应体系：总体积20yL，10X缓冲液，IU Taq酶，0.5mM MgCl2、dNTP/A647-dNTP混合物，上下游引物浓度各0. 25 μΜ ;扩增条件：95°C变性IOmin ; 94°C 10秒，55°C 10秒，72°C 30秒，40个循环，72°C延伸7分钟。
[0016] 所述步骤⑷中的凝胶电泳成像中琼脂糖凝胶浓度为2%，缓冲溶液为IXTBE缓 冲液。
[0017] 所述步骤⑷中PCR产物与SAP酶的比例为10 μ L: 1U，与SAP缓冲液的体积比为 15:1. 8〇
[0018] 所述步骤（4)中的加热温度为65°C，加热时间为20min。
[0019] 本发明利用量子点（QDs)荧光共振能量转移原理实现了定性及定量检测甲基 化（实验原理如图1)。通过甲基化敏感限制性内切酶HpaII的作用，首先分离基因中 5'-CCGG-3'甲基化和非甲基化部分，然后进行PCR扩增掺入A647标记的dNTPs。通过表面 修饰氨基的正电荷量子点与染料掺杂的负电荷DNA之间的静电吸引作用，产生FRET，通过 荧光强度转移程度的比较，可以定量的分析DNA甲基化水平。
[0020] 有益效果
[0021] 本发明操作简便，费用低廉，灵敏度高，可以实现高通量的定性及定量检测甲基化 水平，有着较强的通用性，有很好的应用前景。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的原理图；
[0023] 图2为QD6c?与A647染料的荧光发射和紫外可见光吸收谱图；
[0024] 图3为不同甲基化程度的rcDHGB6，H0XA9和RASSF1A基因的PCR产物的琼脂糖凝 胶成像图；
[0025] 图4为不同甲基化程度的P⑶HGB6基因的FRET图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0027] 实施例1
[0028] (1)巯基乙胺包裹的CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳结构量子点的制备
[0029] 取三辛基氧化磷（TOPO)包裹的CdSe/CdS/ZnS核/壳/壳结构QDs稀释于20mL 正己烷溶液，终浓度为10_6M。在超声条件下，逐滴加入2-5mL溶于水的浓度为20mg/mL的 巯基乙胺（Cys)溶液。超声约IOmin后，量子点转入水层，弃去有机层，在水层中加入丙酮， 离心沉淀后，将得到的QDs溶于Mi 11 i - Q超纯水中，制备得到Cy s包裹的水溶性CdSe/CdS/ ZnS QDs ;
[0030] (2)样本组织的准备
[0031] 利用Qiagen公司组织抽提试剂盒从20对组织样本分离提取DNA。提取的DNA通 过NanoDrop ND-1000仪器测得浓度。DNA样本处理分成两部分：
[0032] L取IOOng基因 DNA样本，加入IOU HpaII甲基化敏感限制性内切酶，1 μ L IOXNEBuffer和超纯水。
[0033] 2.取IOOng基因 DNA样本与1 μ L 10 X NEBuffer和超纯水混合作为对照组。两组 样本37°C过夜处理，然后经过85°C 15min使酶失活。
[0034] (3)基因的选择及引物设计
[0035] 三种基因被选择用于测定甲基化水平，分别为K：DHGB6, H0XA9, RASSF1A。基因引 物设计如下，其序列至少包含2个CCGG。
[0037] (4)甲基化的检测
[0038] 三种基因的甲基化程度是基于量子点FRET联合PCR法检测。处理过的DNA样本 经过一轮PCR扩增引入FRET中能量受体A647, 20 μ L PCR体系：10 X缓冲液，IU Taq酶， 0· 5mM MgCl2、dNTP/A647-dNTP 混合物（8 μ M dATP, 8 μ M dGTP, 7 μ M dCTP, 7 μ M dTTP, 1 μ M