一种通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到硫酸盐还原菌（SRB)的检测，具体为一种通过肉眼观察对SRB进行 半定量检测的方法。
【背景技术】
[0002] 硫酸盐还原菌（SRB)是一类以乳酸或丙酮酸等有机物作为电子供体，在厌氧状态 下，把硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐等还原为硫化氢的细菌总称，它产生的硫化氢可对接 触金属特别是碳钢造成严重腐蚀危害是海洋工程中亟待克服的问题之一。正是因为SRB在 各类环境中广泛的存在及它的危害，对环境中SRB的检测和监控显得非常重要。
[0003] 生物传感技术是利用生物材料（如酶类、抗体、蛋白、细胞、核酸等）将待测物质浓 度的信息转化为适当的光学、电学、热力学或磁学信号的分析器件。而涉及到的检测仪器 也十分广泛，包括光学仪器（荧光光谱仪、紫外分光光度计、流式细胞仪等），电学仪器（电 化学工作站，极谱仪等），磁学信号检测仪器（核磁共振仪、铁磁共振仪及电子自选共振仪 等），而这些检测仪器部分价格高昂，且不便于携带，这对SRB的实时快速检测造成了一定 的障碍。
【发明内容】
[0004] 本发明目的在于保护一种通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一种通过肉眼观察对硫酸盐还原菌进行半定量检测的方法，利用基于溶菌酶-DNA 信号探针，磁性微球-捕获探针对SRB特异性DNA片段进行检测，通过观察反应前后溶液颜 色的变化，实现SRB的定性及半定量检测。
[0007] 进一步的说，磁性微球-捕获探针DNA1，溶菌酶-DNA2信号探针，及不同浓度SRB 特异性DNA片段按1: 1:1的质量比混合，于37-40°C摇床孵育30-60分钟；向孵育后得到 的溶液中加入溶菌酶显色底物混合，于40-50°C，40mM磷酸盐缓冲溶液（pH 5. 0)条件下反 应10-15小时后加入硼酸盐缓冲液pH 9. 3终止反应，观察对反应后的溶液溶液颜色由无色 变为淡黄色，由此对样品中SRB的定性及半定量检测。
[0008] 所述溶菌酶-DNA2信号探针为溶菌酶与DNA2信号探针杂交获得；所述磁性微 球-捕获探针DNAl为将亲和素修饰的磁珠与生物素修饰的捕获探针DNAl杂交获得。
[0009] 所述磁性微球-捕获探针DNAl与目标检测物DNA链部分片段结合形成双链，目标 检测物DNA单链未结合部分与溶菌酶-DNA2信号探针结合。
[0010] 具体见图4:
[0011] 例如 DNA I :biotin-AAAAAAAAATACGGATT(5' -3'），DNA2 :TCACTCCTAAAAAAAAA-ly sozyme (5' _3'）。
[0012] 所述基于溶菌酶-DNA2信号探针为取溶菌酶溶液与sulf〇-SMCC(4-(N-马来酰亚 胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐）按8:1的质量比混合，涡旋5-10分 钟后与室温孵育1-2个小时，反应产物用bufferA超滤6-10次，得溶液A待用；
[0013] DNA活化，取巯基修饰的信号探针DNA2链与二硫苏糖醇溶液按照1:10-1:100的 质量比混合，并在室温反应2-3小时，反应产物再用buffer A超滤6-10次，以出去多余的 DTT0
[0014] 将上述溶液A与活化的DNA按照1:1的体积比混合，并于室温下孵育36-48小时 后再次用bufferA超滤6-10次，去除未结合的溶菌酶即得到基于溶菌酶-DNA信号探针，于 4°C保存以备使用。
[0015] 其中，二硫苏糖醇溶液为二硫苏糖醇溶解于磷酸盐缓冲溶液（0. 1Μ，ρΗ8.0)中，浓 度为125mM ;
[0016] 溶菌酶溶液为溶菌酶溶解于缓冲液中，浓度为10mg/mL，缓冲液为0.1 M NaCl，0.1 M 磷酸盐缓冲溶液，pH 5. 0 ;
[0017] buffer A 为 0.1 M NaCl, 0.1 M 磷酸盐缓冲溶液，pH 7. 4。
[0018] 所述硫酸盐还原菌为对SRB种群在25_40°C，隔绝空气条件下进行富集，然后将 SRB进行清洗并利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA ;
[0019] 以利用SRB特异性引物对上述提取的细菌基因组DNA进行聚合酶链式反应（PCR) 扩增得到特异性DNA片段。
[0020] 所述聚合酶链式反应用量为模板DNA，5. 0-6. 0 μ L ;超纯水，10. 0-16. 0 μ L ; 聚合酶缓冲溶液，L 0-3. OyL;三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs)，0· 5-1. 0 μ L ;上游引 物，1. 0-2. 0 μ L ;下游引物，0. 5-2. 0 μ L ;耐热DNA聚合酶，0. 2-0. 5 μ L ;或所述上下游引物 的用量相反；
[0021] 反应条件为：复制起始（94°C，5-10min) ;35个循环变性（94°C，30-60s)，退火处 理（55°C，30-60s),延伸（94°C，30-60s);终止（72°C，7-10min)。
[0022] 本发明所具有的优点：
[0023] 该方法特异性强，不需要复杂的仪器，可在短时间内对细菌进行半定量检测，具有 很好的现场应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例提供了基于溶菌酶-DNA信号探针对SRB进行显色检测的方 案图。
[0025] 图2溶菌酶催化底物进行显色反应的原理图。
[0026] 图3为本发明实施例提供了基于此方法对不同浓度SRB的DNA片段检测的显色 图。（(a) I X 108,（b) : I X 107,（c) : I X 106,（d) : I X 105,（e) : I X 104,（f) : I X 103,（g) : I X IO2 CFU/mL SRB and Blank)。
[0027] 图4为磁性微球-捕获探针DNAl与目标检测物DNA链部分片段结合形成双链，目 标检测物DNA单链未结合部分与溶菌酶-DNA2信号探针结合图。
【具体实施方式】
[0028] 下面通过实施例对本发明做进一步说明。
[0029] 实施例1
[0030] 通过肉眼观察对硫酸盐还原菌（以食氨酸脱硫弧菌为例）进行肉眼半定量检测的 方法
[0031] 1)提取食氨酸脱硫弧菌的特异性DNA片段
[0032] 取含有食氨酸脱硫弧菌的水溶液（4~6mL)加入到200mL培养基中，培养3~4 天，将细菌进行离心分离（离心速度为8000-10000转/分钟，离心时间8-10分钟）后，将 上层液吸出倒掉，取下层SRB细胞沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒处理。提取纯化得 到的DNA依次与Taq DNA聚合酶及特异性引物混合进行PCR扩增反应，用量如下：DNA模 板，5 μ L ;超纯水，15. 8 μ L ;聚合酶缓冲溶液，2. 5 μ L ;dNTPs，0· 5 μ L ;引物1，0· 5 μ L ;弓丨 物2, 0. 5 μ L ;taq聚合酶，0. 2 μ L。热循环温度如下：预变性（94°C，5min) ;35循环，变性 (94°C，30s),退火（55°C，30s),伸展（94°C，30s);终止（72°C，7min)。
[0033] 2)磁性微球-寡聚核苷酸捕获探针的构建
[0034] 试验中所用到的亲和素修饰的磁性纳米微球（1. 02 μ m, IOmg. ml/1)购买于挪威英 杰生命科技有限公，所需的人工合成寡聚核苷酸（DNA1，DNA2)由上海生工生物工程有限公 司合成。
[0035] 所述 DNA 序列为 DNA I :biotin-AAAAAAAAATACGGATT(5' -3'），DNA2 : TCACTCCTAAAAAAAAA-SH(5' -3' ）；
[0036] 首先，取IOuL