用于牛支原体检测的特异性引物对、检测试剂盒及其使用方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于体外诊断技术领域，具体涉及用于牛支原体检测的特异性引物对及相 应的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 牛支原体是牛呼吸系统疾病的主要病因之一，其可引起牛的肺炎、结膜炎、关节 炎、乳房炎、生殖道炎症以及流产和不孕等疾病（Assie等，2009)。1898年，法国人Nocard 和Roux等首次在患呼吸系统疾病的病牛肺脏中分离到该支原体（Hale等，1962)。1961年， 美国人Hale等首次从在患乳房炎奶牛的牛奶中分离出牛支原体。之后，牛支原体及其相关 疾病迅速扩散至世界各个国家和地区的牛群，对世界养牛业的健康发展造成了极大的威胁 (Nicholas 等，2003)。
[0003] 1983年，我国学者黎济申等首次从国内乳房炎患病奶牛的乳汁中分离出牛支原体 (黎济申，1983)。2008年以来，我国多地相继发生并广泛流行的以发热、咳嗽和流鼻涕为主 要症状，以坏死性肺炎为主要病变的牛呼吸道传染病亦被确定为牛支原体感染所致的牛支 原体肺炎(辛九庆等，2008 ;胡长敏等，2009)。由于该病常规药物疗效不佳，且无有效疫苗进 行预防，因此给我国的养牛业造成了严重经济损失。
[0004] 由于牛支原体肺炎临床症状无特殊性，临床上极易与其他呼吸道疾病相混渚，因 此，目前牛支原体肺炎的实验室诊断方法主要有病原学诊断、免疫学诊断、分子生物学诊断 等。其中，病原学诊断最为确实，但却需要耗费较长的时间。而血清学诊断方法中常规的 常规的抗体检测方法诊断牛支原体肺炎灵敏度低，非特异性高。应用高亲和力的单克隆抗 体建立的牛支原体检测方法，虽然具有较高的灵敏度，但却往往不能对牛支原体和无乳支 原体进行有效鉴别。因此，快速、灵敏和特异的牛支原体检测方法的建立对牛支原体肺炎的 及时、准确诊断和有效控制具有重要意义。虽然PCR技术被广泛应用于牛支原体肺炎的实 验室诊断（Soehnlen 等，2011 ;Justice_Allen 等，2011 ; Aebi 等，2012)，但绝大大多数为 了对牛支原体与无乳支原体进行鉴别而采用套式PCR检测技术或多种PCR技术，从而相对 延长了检测所需时间或增加了实验的复杂程度。（李嫒等，2009 ;刘洋等，2010 ;辛庆九等， 2010)〇
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了用于牛支原体检测的特异性引物 对，以及相应的PCR检测试剂盒。
[0006] 本申请人通过对已完成基因组序列测定的牛支原体基因序列的比较分析，筛选出 高度保守的膜表面蛋白基因序列，并与本实验室分离的不同菌株的相应基因序列进行比 较，获得牛支原体高度保守的表面蛋白基因序列。在此基础上，在NCBI中进行BLAST检测， 比较该基因序列与其他病原微生物核酸序列的同源性，依此设计并合成PCR扩增引物。
[0007] 本申请人通过对牛支原体基因组的比较分析发现，不同菌株的牛支原体脂蛋白 P48基因高度保守，国内外来源的菌株其P48脂蛋白基因序列完全一致。而该基因序列与无 乳支原体的相关基因序列存在数个碱基的差异。因此，本申请人根据牛支原体P48脂蛋白 基因和无乳支原体基因之间的差异，设计并筛选出一对特异性PCR扩增引物，建立了牛支 原体的PCR快速检测方法，该方法可快速、灵敏并特异地对牛支原体进行检测，从而为牛支 原体肺炎的快速诊断提供了新的技术手段。
[0008] 本申请提供的用于牛支原体检测的特异性引物为： 上游引物 P48-F :CGAACCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT ; 下游引物 P48-R :ATTACTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG。
[0009] 本申请提供的一种用于牛支原体检测的PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含权利要 求1所述的引物对。
[0010] 优选地，所述PCR试剂盒由以下成分组成：2XPCR Mix 12. 5yL ;10μΜ上游引物 0· 5 μ L ;10 μ M下游引物0· 5 μ L ;待检样品4 μ L ;超纯水补至总体积25 μ L。 toon] 本申请的第三个目的是提供上述试剂盒的使用方法，步骤如下： (1) 牛支原体基因组DNA的提取； (2) 牛支原体基因组DNA的PCR扩增，PCR反应条件为：95°C预变性5min，95°C变性30 秒，55°C退火45秒，72°C延伸45~50秒，30~40个循环，72°C延伸5~10min。
[0012] 本申请的第四个目的是提供上述引物对在制备用于牛支原体检测的PCR检测试 剂盒中的应用。
[0013] 优选地，所述牛支原体检测方法如下： (1) 待检样品牛支原体基因组DNA的提取； (2) 牛支原体基因组DNA的PCR扩增，PCR反应条件为：95°C预变性5min，95°C变性30 秒，55°C退火45秒，72°C延伸45~50秒，30~40个循环，72°C延伸5~10min ; (3) 电泳，对电泳结果进行分析：有特异性扩增产物的目的条带，即为待检样品中有牛 支原体；反之，则无。
[0014] 优选地，步骤（1)中待检样品牛支原体基因组DNA的提取方法为：（1)采集牛肺脏 组织，不以有生命的动物体及其离体样品作为采集对象； (2) 将组织病料经匀浆处理后与2倍体积的去离子水混匀； (3) 3000 rpm 离心 IOmin ; (4) 取上清并用0. 45 μ m的滤器过滤以除去大颗粒物质； (5) 将滤液经12000rpm离心10 min ; (6) 弃上清，沉淀悬浮于30 μ L去离子水，并沸水浴10 min后再冰浴5min ; (7) 12000 rpm离心5min，吸取上清即得。
[0015] 本申请的第五个目的是提供一种适用于牛支原体PCR检测的临床样品处理方法， 步骤如下： (1) 采集牛肺脏组织，不以有生命的动物体及其离体样品作为采集对象； (2) 将组织病料经匀浆处理后与2倍体积的去离子水混匀； (3) 3000 rpm 离心 IOmin ; (4) 取上清并用0. 45 μ m的滤器过滤以除去大颗粒物质； (5) 将滤液经12000rpm离心10 min ; (6) 弃上清，沉淀悬浮于30 μ L去离子水，并沸水浴10 min后再冰浴5min ; (7) 12000 rpm离心5min，吸取上清即得。
[0016] 与现有牛支原体检测方法相比，本发明的主要优点在于： (1)本方法操作简便：本方法仅用一对引物对牛支原体进行PCR检测，相较以前所用的 套式PCR等技术，操作更加简便，填补了国内应用单一引物对对牛支原体进行有效鉴别诊 断的空白。且本方法对样品的处理亦较简单，从而便于操作。
[0017] (2)本方法特异性高：本方法所应用的引物对特异性高，能够有效将牛支原体与无 乳支原体等其他病原微生物进行鉴别，而传统的分离和鉴定方法，常因非特异性细菌的增 殖而影响结果的判定。套式PCR法虽然具有高特异性，但需要两次PCR，因此耗时较长。
[0018] (3)本方法敏感性高：对数生长中后期的牛支原体培养物（IO9个支原体/mL)经 IO9倍稀释后，应用本方法仍能检出阳性。
[0019] (4)本方法检测所需时间短：本方法可在2小时内判定结果，而传统的培养方法则 至少需要一周以上时间。
[0020] (5)本方法检测结果稳定：应用本方法对同一样品进行不同批次的检测，或不同的 操作人员，其结果一致性高，因而适合大批量样品的检测和分析。
[0021] (6)本发明还提供了一种适用于牛支原体PCR检测的临床样品处理方法，该方法 通过对临床采集的组织材料简单处理即可用于PCR扩增，从而简化了操作程序，缩短了整 个检测过程所需时间，从而为及时采取措施进行疫情的防控创造了先机。
【附图说明】
[0022] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本申请的特异性引物对的特异性分析；其中，M为DNAMarker DL5000,泳道1~8 分别为1 :牛支原体基因组；2 :丝状支原体丝状亚种小菌落型基因组；3 :无乳支原体基因 组；4 :鸡毒支原体BG44T基因组；5 :鸡毒支原体Rlow株基因组；6 :滑液支原体WUV1853株 基因组；7 :巴氏杆菌基因组；8 :空白对照。
[0023] 图2为PCR检测方法的敏感性分析；其中M为DNAMarker DL5000,泳道1~13分 别为l〇7mL的牛支原体培养液的ΙΟ?ΚΓ13的稀释液PCR扩增产物，N为空白对照。
[0024] 图3为组织病料进行的PCR扩增；其中M :DNA Marker DL2000 ;1~7 :不同来源的 牛支原体肺炎疑似组织病料；8 :空白对照。
【具体实施方式】
[0025] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0026] 本申请所用特异性引物的设计基础为牛支原体脂蛋白P48基因，在现有技术已 测定的牛支原体菌株中该基因序列完全一致，其与无乳支原体的不同菌株间同源性达 89%~94%，依据牛支原体与无乳支原体P48基因之间的差异设计引物对P48-F/P48-R，并进 行PCR扩增，检测结果效果最佳。
[0027] 下面对本发明进行进一步的阐述。
[0028] 实施例1引物的合成及支原体基因组的PCR扩增 1引物合成 P48-F ：CGAACCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT P48-R :ATTACTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG。
[0029] 2样品的准备 1) 取对数生长中后期的牛支原体液体培养物lmL，加入到I. 5mL的无菌离心管中， 12000rpm 离心 IOmin ; 2) 弃上清，用15 μ L无菌超纯水悬浮沉淀； 3) 将悬浮的沉淀于沸水中煮IOmin后，再冰浴3min ; 4) 12000rpm离心10min，上清即为粗提的牛支原体基因组DNA，取上清10 μ L并移入 PCR管中，直接进行PCR扩增或置-20°C保存备用； 5) 鸡毒支原体、滑液支原体的基因组提取如上所述，丝状支原体丝状亚种小菌落型基 因组和无乳支原体PG2株基因组由哈尔滨兽医研宄所惠赠，巴氏杆菌基因组用细菌基因组 提