检测肺炎克雷伯氏菌的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及菌种的PCR检测技术领域，特别是涉及用于检测肺炎克雷伯氏菌的荧 光定量PCR引物对和探针，本发明还涉及利用该引物对和探针进行肺炎克雷伯氏菌检测的 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌属于革兰氏阴性菌，杆状，有大量黏性的多糖形成的荚膜包覆。肺 炎克雷伯氏菌为呼吸道感染的重要病原体，常引起重症肺炎，还可引起泌尿道感染、胆道感 染、败血症和化脓性脑膜炎等严重疾病。感染多发生于住院的衰弱患者。病原体往往从上 呼吸道吸入，或通过污染的人工呼吸器、雾化器或各种导管侵入人体。肺炎克雷伯氏菌已成 为医院内感染的重要致病菌之一，在某些国家中占院内感染的首位。因此，临床上迫切需要 一种快速、准确的体外检测手段辨识菌种类型，进行有针对性的个体化治疗。
[0003] 传统的细菌检验方法主要通过涂片镜检和分离培养的方法对细菌生理化特征进 行分类。涂片镜检的方法需要有丰富经验的技术工作者根据细菌形态、排列方式和染色性 作出初步诊断，分离培养需要较长的时间才能进行结果判读，不利于及时诊断病原。患者有 病情恶化蔓延的风险。荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵 敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、稳定性好、无污染、实时和准确等特点， 目前已广泛应用于分子生物学研宄和医学研宄等领域。而传统的肺炎克雷伯氏菌检测方法 具有耗时长、检出率低、准确性低和重复性差的缺点。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供用于检测肺炎克雷伯氏菌的试剂盒。
[0005] 为实现上述目的，发明人对NCBI数据库已报道的肺炎克雷伯氏菌phoE基因序列 比对，通过BLAST软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，发现了核苷酸完全 保守区域，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，该靶序列是检测肺炎克雷伯氏菌的遗传标记 物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测肺炎克雷伯氏菌 的遗传标记物。
[0006] 进一步，本发明还提供用于特异性扩增上述靶序列的引物，以及与所述引物配合 使用的焚光探针。可以使用诸如Primer Express Version 3等软件来设计探针和引物。通 常引物长度为15-30个碱基，一条引物序列与本发明提供的遗传标记物序列相同，另一条 引物序列与该遗传标记物序列互补；通常Taqman探针长度为20-50个碱基，其序列与上述 遗传标记物相同或互补，其5'标记荧光基团FAM，3'标记淬灭基团BHQ-I。
[0007] 在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：
[0008] 上游引物：5 ' -GATGGGCTTTGTGGCTTCAA-3 '
[0009] 下游引物：5 ' -CCAGCTTGTTCGCGTTCTTAT-3 '。
[0010] 探针序列为：
[0011] (FAM) 5 ' -AGCGACGCAGGCAGCGGAA-3 '（BHQl)。
[0012] 本发明提供了上述特异性引物对和荧光探针在制备检测肺炎克雷伯氏菌试剂盒 中的应用。
[0013] 本发明提供一种肺炎克雷伯氏菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总 DNA为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量 PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
[0014] 本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20 μ 1反应体系时，其优选配置 为：
[0015]
[0016]
[0017] 本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：预变性95°C、5min ;再经95°C变性 15s，60°C退火60s，35个循环。
[0018] 本发明每次检测标本时必须设立NTC对照（无模板对照）和POS对照（阳性对 照），两种对照对于结果判读起决定性作用：
[0019] 有效扩增：NTC ( -）和 POS (+)
[0020] 无效扩增：NTC (+)和POS (+)提示体系污染
[0021] 无效扩增：NTC( -）和POS ( -）提示体系错误或者试剂失效。
[0022] 在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种 对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
[0023] Ct值小于等于28的标本为阳性结果；
[0024] Ct值大于35的标本为阴性结果；
[0025] Ct值在28-35之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于28判定为阳性扩 增，超过28判定为阴性扩增。
[0026] 本发明提供了一种检测肺炎克雷伯氏菌的试剂盒，其包括上述特异性引物以及配 合引物对使用的Taqman探针。
[0027] 本发明试剂盒含有的特异性引物对和荧光探针的序列为：
[0028] 上游引物：5 ' -GATGGGCTTTGTGGCTTCAA-3 '
[0029] 下游引物：5 ' -CCAGCTTGTTCGCGTTCTTAT-3 '。
[0030] 探针序列为：
[0031] (FAM) 5'-AGCGACGCAGGCAGCGGAA-3'（BHQl)。
[0032] 本发明提供的试剂盒，还包括荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模 板为去核酸水，所述阳性模板为肺炎克雷伯氏菌标准阳性模板。
[0033] 本发明提供了用于检测肺炎克雷伯氏菌的phoE基因保守区域靶序列，以及以该 序列为基础设计的引物和探针，具有较强的特异性，利用该引物和探针进行肺炎克雷伯氏 菌的荧光定量PCR检测方法进一步简化肺炎克雷伯氏菌的检测的程序、缩短检测周期，用 于检测肺炎克雷伯氏菌株，可作为检测临床标本的手段，提高肺炎克雷伯氏菌检测的阳性 率。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性阳性对照，该试剂 盒的推广应用有利于快速、准确地鉴定肺炎克雷伯氏菌。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明实施案例1中的肺炎克雷伯氏菌不同引物探针组合的荧光扩增曲 线，横坐标为阈值循环数Ct值，纵坐标为相对荧光值，其中1代表引物探针组合（1)，2代表 引物探针组合（2)，3代表引物探针组合（3)，4代表三种反应体系的阴性对照。
[0035] 图2为本发明实施案例2中的的肺炎克雷伯氏菌的特异性检测荧光扩增曲线，横 坐标为阈值循环数Ct值，纵坐标为相对荧光值，其中1代表肺炎克雷伯氏菌，2代表屎肠球 菌、粪肠球菌、金黄色葡糖球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌、溶血 葡萄球菌和阴性对照。
[0036] 图3为本发明实施案例3中的的肺炎克雷伯氏菌的灵敏度检测荧光扩增曲线，横 坐标为阈值循环数Ct值，纵坐标为相对荧光值，其中1代表1 X IO6CFUAiI菌液的模板，2代 表1 X 105CFU/ml菌液的模板，3代表1 X 104CFU/ml菌液的模板，4代表1 X 103CFU/ml菌液 的模板，5代表1 X 102CFU/ml菌液的模板，6代表阴性对照。
[0037] 图4为荧光定量PCR标准曲线，横坐标为初始模板浓度的对数，纵坐标为阈值循环 数，Ct = -3. 5081gXQ+34. 933,其中Ct为阈值循环数，X。为初始模板浓度（拷贝/ml)，R2 = 0.9947。
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0039] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0040] 实施例1荧光定量PCR检测肺炎克雷伯氏菌的方法的建立
[0041] 1、引物和探针设计
[0042] 针对肺炎克雷伯氏菌的PhoE基因保守区域，本实施例设计了 3对引物及与其配合 使用的探针，3对引物均位于phoE基因上，其核苷酸序列如下：
[0043] (1)
[0044] 上游引物：5 ' -GATGGGCTTTGTGGCTTCAA-3 '
[0045] 下游引物：5 '-CCAGCTTGTTCGCGTTCTTAT-3'
[0046] 探针：5 '-AGCGACGCAGGCAGCGGAA-3'
[0047] (2)
[0048] 上游引物：5 ' -CGAT