检测TLR7/8介导的NF-κB信号通路中关键分子含量的特异性引物、扩增程序及定量试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，是一种基于聚合酶链式反应（PCR)的分子生物学方法， 特别是涉及荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR)。 技术背景
[0002] mRNAs是普遍存在于动物生物体内的核苷酸，其表达量受到多种因素的调节。mRNA 的表达量也对蛋白质的合成有重要作用。通过定量mRNA的表达水平可以反映蛋白质的表 达量，间接的表现各种蛋白质在生物体内生物学功能的变化。TLR7/8介导的MyD88依赖型 NF- κ B信号通路中关键分子的差异表达在抗病毒的研宄中有着至关重要的作用。
[0003] 目前所知，NF-K B调节的靶基因编码蛋白至少包括细胞因子、趋化因子、生长因 子、转录因子、粘附分子、免疫受体、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等。通过靶基因表达产 物，NF-κ B信号通路参与了感染、炎症、免疫反应等过程。
[0004] Toll样受体（Toll like receptor，TLR)是上世纪末发现的一类天然免疫受体， 1997年Medzhitov等.率先报道了人类TLR，随后受到了广泛的关注。Toll样受体分布十 分广泛，主要表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、多形核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞 及自然杀伤细胞等表面，属于模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR)，可对 病原体相关分子模式（pathogen associated molecu -Iar patterns，PAMP)进行识别、结 合，并引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的释放，在天然免疫防御中起着重要作用， 并最终激活获得性免疫系统。
[0005] Toll 样受体 7/8 (Toll -like receptors，TLR7/8)可识别某些种类病毒 ssRNA， TLR7/8识别病毒后依赖MyD88途径将信号下传，激活细胞内转录因子核因子κ B (NF- κ B) 信号通路发挥先天抗病毒免疫反应，导致共刺激分子活化和细胞因子产生，并引发随后的 特异性免疫应答，以起到天然免疫防御的作用。
[0006] NF-κ B信号通路的作用十分广泛，尤其是在天然抗病毒免疫防御中起到重要的作 用。根据目前的研宄表明，病毒可以通过激活NF- κ B信号通路，进而诱导固有免疫功能改 变，目前研宄病毒致病或者感染机制中更注重宿主在病毒感染过程中免疫反应变化。在病 毒感染机体后，快速有效的检测NF-κ B通路中关键分子的差异性表达对我们研宄病毒的 感染机制是非常必要的，但是目前的检方法由于技术缺陷、操作繁琐、试验时间长、无标准 化、成本高等原因让试验者面临很大的困难。我们通过建立荧光定量PCR技术平台，开发出 便捷的检测方法。该方法依靠 PCR技术的高灵敏性和荧光定量技术，可以一次性对TLR7/8 介导的MyD88依赖型NF- κ B信号通路中的多个关键分子基因进行相对定量，检测病毒感染 后不同时期TLR7/8介导的MyD88依赖型NF- κ B信号通路关键分子的表达量的差异，并通 过荧光定量的方法将结果直观的表现出来，以更加简便快捷的研宄病毒的致病机制。
[0007] 通过对感染病毒机体组织或者体外感染细胞，完成中RNA或者短片段RNA的提取， 在荧光定量PCR仪上进行检测，快速获得结果。这个过程可以有效的缩短实验时间，减少经 费使用和试剂仪器使用。本发明可以同时检测多种mRNA的动态变化，使的原来很难采用统 一常规技术检测的一组数据可以通过标注化的试剂盒在短时间内得到表达差异，并完成定 量分析。
[0008] 目前，还没有开发出一种准确、快速、简单费用低廉的检测TLR7/8介导的MyD88依 赖型NF-κ B信号通路中关键分子mRNA表达水平的技术。本发明基于荧光定量，通过一整套 的特异引物进行荧光定量分析，进行相对定量的检测，解决了目前对TLR7/8介导的MyD88 依赖型NF- κ B信号通路中关键分子快速检测的技术瓶颈。同时，我们对检测的关键分子在 96孔板上进行合理排布，使其得到更加充分的利用，能过更加高效的进行研宄分析。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是开发出一种准确、快速、简单的检测TLR7/8介导的MyD88依赖型 NF- κ B信号通路中关键分子mRNA表达水平的技术。本发明基于荧光定量，通过一整套的特 异引物进行荧光定量分析，进行相对定量的检测，解决了目前对TLR7/8介导的MyD88依赖 型NF- κ B信号通路中关键分子快速检测的技术瓶颈。同时，我们对检测的关键分子在96 孔板上进行合理排布，使其得到更加充分的利用，能过更加高效的进行研宄分析。
[0010] 本发明的技术方案是： 一种检测TLR7/8介导的NF- κ B信号通路中关键分子含量的特异性引物，序列如下： 用于对TLR7进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2所示，该 序列与猪TLR7 mRNA的一段互补； 用于对TLR8进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示，该 序列与猪TLR8 mRNA的一段互补； 用于对IRAKI进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示， 该序列与猪IRAKI mRNA的一段互补； 用于对IRAK4进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8所示， 该序列与猪IRAK4 mRNA的一段互补； 用于对TRAF6进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10所示， 该序列与猪TRAF6 mRNA的一段互补； 用于对TAKl进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :12所示， 该序列与猪TAKl mRNA的一段互补； 用于对TAB2进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14所示， 该序列与猪TAB2 mRNA的一段互补； 用于对IKKa进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16所示， 该序列与猪IKK a mRNA的一段互补； 用于对Ικ Ββ进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所 示，该序列与猪Ικ Ββ mRNA的一段互补； 用于对RELA进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示， 该序列与猪RELA mRNA的一段互补； 用于对MyD88进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22所示， 该序列与猪MyD88 mRNA的一段互补； 用于对β-Actin进行定量PCR的特异性引物，序列如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所 示，该序列与猪β-Actin mRNA的一段互补。
[0011] 一种检测TLR7/8介导的NF- κ B信号通路中关键分子含量的扩增程序：95°C预变 性30s ;进行40个循环扩增：95°C变性15s，60°C延伸30s，同时采集荧光信号强度。
[0012] 含有权利要求1所述的检测TLR7/8介导的NF- K B信号通路中关键分子含量的特 异性引物的定量试剂盒，试剂盒包含荧光定量反应预混酶和含有引物的荧光定量96孔反 应板，试剂盒由下述部分组成： 2. 5 mL荧光定量预混酶；3 mL无菌水；含有特异性引物的PCR 96孔反应板一块。
[0013] 本发明的有益效果是：TLR7/8介导的MyD88依赖型NF- κ B信号通路中关键分子 的差异表达在抗病毒的研宄中有着至关重要的作用，对病毒性疾病的防治具有重要意义。 已经表明，多种病毒性疾病在感染机体的过程中引起TLR7/8介导的MyD88依赖型NF- κ B 信号通路中关键分子mRNA表达谱的改变，通过本发明设计，各种引物的反应温度都进行了 标准化，片段长度也进行了标准化，所有的mRNA定量均可以在相同条件下完成，使不同的 实验间具有可比性。本发明能够建立在mRNA检测的荧光定量PCR技术平台上，不仅可以缩 短实验时间，减少实验经费使用，提高实验结果的准确性和说服力，提供一个全新的检测标 准和评估体系。通过病毒感染后组织采样或者人工培养细胞系快速完成总RNA的提取，并 于荧光定量PCR上进行检测。本发明有效的缩短实验时间、减少经费的使用等。通过优化 的实验反应体系和反应条件，组成检测灵敏、方便的试剂盒，为TLR7/8介导的MyD88依赖型 NF- κ B信号通路中关键分子提供可靠的检测技术。
【附图说明】
[0014] 图1为96孔反应板的整体布局。
[0015] 图2为标本TLR7检测的溶解曲线； 图3为TLR8检测的溶解曲线； 图4为IRAKI检测的溶解曲线； 图5为IRAK4检测的溶解曲线； 图6为TRAF6检测的溶解曲线； 图7为TAKl检测的溶解曲线； 图8为TAB2检测的溶解曲线； 图9为IKKa检测的溶解曲线； 图10为I κ Ββ检测的溶解曲线； 图11为RELA检测的溶解曲线； 图12为β-Actin检测的溶解曲线； 图13为MyD88检测的溶解曲线。
【具体实施方式】
[0016] 以Genbank公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用DNASTAR软件进 行序列比对，选取针对各个靶基因高度保守与特异的基因片段，用Premier软件设计了相 关引物，引物方向均为Y -3'，具体如下： SEQ ID NO ：1 CAGATGAAACCCAGTAGC SEQ ID NO ：2 CAATGATGTTGCCGTAGA SEQ ID NO ：3 ACGGATGTCATTTGTGCC SEQ ID NO ：4 AGAGCCGTCTTTGGTGTC SEQ ID NO ：5 CCGCTTCTACAAGGTGATGGA SEQ ID NO ：6 AGGGTGGAGGTTGACGAGTG SEQ ID NO ：7 GACGATACTCCACCACTCT SEQ ID NO ：8 TGTCTGGGCAAACTTCTC SEQ ID NO ：9 GCGTATGACAGCCACCTCC SEQ ID NO ：10 AACCCTCCCTCCGAAGAC SEQ ID NO ：11 GACCTGAAACCACCAAAC SEQ ID NO ：12 TTCCCAAAGAATAATACCC SEQ ID NO ：13 ATAGTGCCATTGGATAGGG SEQ ID NO ：14 AAGGGA