一套用于快速鉴定8种重要豆象种类的特异性引物及其试剂盒和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测鉴定技术，具体地说涉及对8种重要豆象分子鉴定的特异性 引物及快速分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 豆象科（Bruchidae)昆虫具有普遍意义上的检疫性有害生物所具有的共同特征， 即潜在重大经济重要性、通过人为传播途径而扩散、无分布或分布未广、防治困难等，受到 世界上多数国家的关注。美国、日本、智利、波兰等国将豆象科昆虫整体确定为检疫性有害 生物；保加利亚、捷克等将瘤背豆象属Callosobruchus spp.列入检疫性有害生物名录。
[0003] 豆象的大多数种类已在世界各地广泛分布，主要是人为的因素在大陆内或大陆间 的贸易造成的。比如，四纹豆象（Callosobruchus maculatus)是上世纪60年代随港澳旅 客携带的豆类传入的，现已蔓延到广东、广西等省区。巴西豆象（Zabrotes subfasciatus) 也随着国际贸易而扩散至整个热带和亚热带地区并成功定殖。中国口岸检疫部门频繁截获 到重要的豆象种类。1998年4月16日，扬州动植物检疫局在泰州港对一艘来自韩国的巴拿 马籍货轮登轮检疫时，在其食品干货舱内的食用菜豆中截获大量菜豆象（Acanthoscelides obtectus)〇
[0004] 在豆象的生活史中，雌成虫将卵产于豆荚或豆粒表面，卵孵化后即钻入豆粒内完 成幼虫、蛹与成虫的发育历程。随着我国加入WT0,农产品贸易日益频繁。在出口或进口豆 科植物时，中国口岸检疫部门频繁截获到重要的豆象种类。其中，绿豆象Callosobruchus chinensis (Linnaeus)、四纹豆象Callosobruchus maculatus (Fabricius)、香豆象Bruchus rufimanus (Boheman)、碗豆象 Bruchus pisorum(Linnaeus)、鹰嘴豆象 Callosobruchus analis(Fabricius)、灰豆象 Callosobruchus phaseoli(Gyllenhall)、菜豆象 Acanthoscelides obtectus (Say)和巴西豆象Zabrotes subfasciatus (Boheman)都属于豆 象科，是重要的仓储害虫，危害多种豆科植物，属于检疫性害虫。
[0005] 而这几种豆象有的外部形态非常相似，由于传统形态分类要求对象物种标本的完 整性以及对其生物学的详细了解使得常规的形态分类进行鉴定十分困难，如果截获的豆象 是处于幼虫期，则更增加了鉴定的难度。目前国内外对其检测识别仅限于形态上，未见有关 其分子鉴定方法的研宄。即使是通过传统的分子检测方法，利用DNA测序技术虽然能够准 确鉴定，但一方面测序成本比较高，另一方面测序过程所需时间周期比较长，达不到快速的 要求。因此目前需要尽快建立一套快速灵敏的鉴定检测方法，以便对这八种豆象作出准确、 快速的鉴定，从而确保对外贸易的正常发展。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一套用于快速鉴定八种重要豆象种类的特异性引物，它能满足 现有技术的上述需求。
[0007] -套用于快速鉴定八种重要豆象种类的特异性引物，其序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ; SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 ; SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 ;SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 ;SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 ;SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 ;SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示。
[0008] 本发明还公开了几种重要豆象线粒体COI基因序列扩增方法，是采用上述的引 物，用50 μ I PCR体系在特定PCR扩增条件下进行目标片段扩增。
[0009] 所述的 50 μ I PCR 体系是：5 μ I 10Xbuffer(+Mg2+)，2· 5 μ I dNTP(2. 5mM)，3 μ 1 引物 LeC0I-F(10yM)，3yl 引物 LeC0I-R(10yM)，0.5yl rTaq 酶（5μ/μ1)，2μ1 DNA 模 板（IOOng)，34 μ 1 双蒸水。
[0010] 所述的PCR扩增条件是：94°C预变性5分钟，94°C变性1分钟15秒，退火温度 (Tm) 1分钟15秒，72°C延伸1分钟5秒，共35个循环，最后72°C延伸10分钟。
[0011] 本实验从分子水平依据八种豆象线粒体COI基因设计出八种引物，利用这八种引 物在相同的PCR程序下进行扩增，结果显示这八种引物的扩增结果及其扩增组合能够有效 快速地区分出八种豆象。同时每种豆象都设置了 4个重复，结果显示该套引物对于不同的 豆象以及同种豆象的4个重复均体现出较好的稳定性，保证了鉴定结果的准确性，说明该 套引物具有较高的灵敏度，填补了豆象科昆虫无分子鉴定方法的空白。
[0012] 另外，可以将本发明引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明的试剂 盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或 者多个可以装有本发明的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。 另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发 明所需要的其它成分及用具。该试剂盒能够同时快速准确地鉴别出绿豆象，四纹豆象，蚕 豆象，豌豆象，鹰嘴豆象，灰豆象，菜豆象和巴西豆象八种豆象，同时该试剂盒检测方法无需 对反应体系及反应程序进行调整，而且整个检测过程（包括PCR反应和电泳检测）耗时不 到3小时，大大缩短了检测时间。本试剂盒的缺点是必须确定待测样品属于绿豆象，四纹豆 象，蚕豆象，豌豆象，鹰嘴豆象，灰豆象，菜豆象和巴西豆象才能适用，一旦超出这八种豆象 范围，该试剂盒不再适用，但可以根据需要重新设计一对或多对上游引物，利用其扩增结果 及其组合，在原来试剂盒的基础上重新修改构成一个新的试剂盒，因此，利用该种方法构建 的试剂盒可控性很好，可以随时根据检疫对象而扩大试剂盒的检测范围。能显著降低实验 成本，缩短实验周期，提高实验的准确性。
[0013] 本研宄建立了适合口岸应用的简便的检测方法，即直接从进、出境的豆科类材料 上检测豆象，操作快捷、结果准确，避免了用传统的形态分类学和细胞学方法所产生的耗费 时间和易疏漏的缺陷，顺应了当今口岸检测工作的特点。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明引物对SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2扩增八种豆象电泳检测图谱。
[0015] 其中，泳道1-4号为蚕显象，5-8号为豌显象，9-12号为绿显象，13-16号为四纹显 象，17-20号为鹰嘴豆象，21-24号为菜豆象，25-28号为巴西豆象，29-32号为灰豆象，M为 Marker DL 2000〇
[0016] 图2是本发明引物对SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4扩增八种豆象电泳检测图谱。
[0017] 其中，泳道1-4号为蚕豆象，5-8号为豌豆象，9-12号为绿豆象，13-16号为四纹豆 象，17-20号为鹰嘴豆象，21-24号为菜豆象，25-28号为巴西豆象，29-32号为灰豆象，M为 Marker DL 2000〇
[0018] 图3是本发明引物对SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6扩增八种豆象电泳检测图谱。
[0019] 其中，泳道1-4号为蚕显象，5-8号为豌显象，9-12号为绿显象，13-16号为四纹显 象，17-20号为鹰嘴豆象，21-24号为菜豆象，25-28号为巴西豆象，29-32号为灰豆象，M为 Marker DL 2000〇
[0020] 图4是本发明引物对SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8扩增八种豆象电泳检测图谱。
[0021] 其中，泳道1-4号为蚕显象，5-8号为豌显象，9-12号为绿显象，13-16号为四纹显 象，17-20号为鹰嘴豆象，21-24号为菜豆象，25-28号为巴西豆象，29-32号为灰豆象，M为 Marker DL 2000〇
[0022] 图5是本发明引物对SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10扩增八种豆象电泳检测图谱。
[0023] 其中，泳道1-4号为蚕显象，5-8号为豌显象，9-12号为绿显象，13-16号为四纹显 象，17-20号为鹰嘴豆象，21-24号为菜豆象，25-28号为巴西豆象，29-32号为灰豆象，M为 Marker DL 2000〇
[0024] 图6是本发明引物对SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12扩增八种豆象电泳检测图谱。 其中，泳道1-4号为蚕豆象，5-8号为豌豆象，9-12号为绿豆象，13-16号为四纹豆象，17-20 号为鹰嘴显象，21-24号为菜显象，25-28号为巴西显象，29-32号为灰显象，M为Marker DL 2000 〇
[0025] 图7是本发明引物对SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14扩增八种豆象电泳检测图谱。 其中，泳道1-4号为蚕豆象，5-8号为豌豆象，9-12号为绿豆象，13-16号为四纹豆象，17-20 号为鹰嘴显象，21-24号为菜显象，25-28号为巴西显象，29-32号为灰显象，M为Marker DL 2000 〇
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