吡唑啉衍生物及其作为酪氨酸酶抑制剂的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于制药技术领域，具体涉及一种吡唑啉衍生物及其用途。
【背景技术】
[0002] 酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶。它与色素障碍性疾病及色素异常沉积有 关，也是引起果蔬发生酶促褐变的主要因素，同时影响着昆虫的免疫及生长。由于它存在 广泛，在医疗、美白、保鲜、杀虫方面均有很好的应用前景。酪氨酸酶具有单酚酶和双酚酶 活力，单酚酶在催化过程中具有迟滞效应的特征，酶浓度、底物、效应物均会影响迟滞时间 的长短。
[0003] 酪氨酸酶是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，它先将酪氨酸羟化，产生邻位 二羟基苯丙氨酸（L-多巴），然后再将多巴氧化成多巴醌，进而生成一系列引起褐化的色素 物。近年来，除对该酶进行结构功能的基础研宄外，由于色素障碍性疾病、恶性黑色素瘤、 白化病和老年性痴呆的发生与治疗，均与酪氨酸酶直接相关，国内外对该酶的研宄主要集 中在医药方面。对于该酶抑制剂的研宄，国内研宄较少且不够深入，主要是一些用于皮肤 保健和治疗的常规抑制剂的研宄。在国外，美国加州Berkeley大学的Kubo教授对酪氨酸 酶抑制剂的研宄最为前沿。Kubo教授已从天然植物（茴芹、腰果等）中提取了一系列该酶 的抑制剂（主要为黄酮类天然产物），测定了它们对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。但有关酪 氨酸酶抑制作用机理的研宄，国内外均报道较少。
[0004] 在酪氨酸酶抑制剂中，羰基化合物包括查尔酮，黄烷酮和吡唑衍生物获得了广泛 的关注，由于其与酪氨酸酶双核铜活性位点附近的疏水蛋白质口袋之间的相互作用。我们 研宄展示了一系列α，β-不饱和羰基化合物作为潜在酪氨酸酶抑制剂。分析抑制机理表 明，这种类似于氨基硫脲衍生物和姜黄素的化合物，在酪氨酸酶的活性部位具有两个复合 铜呙子。
[0005] 基于上述发现，我们推测有取代的苯甲醛和酮的耦合产物不仅与酪氨酸酶的双核 铜活性位点复合，也与疏水酶口袋有相互作用，因此提高了抑制剂-酶的结合亲和力，加强 对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。查尔酮是苯甲醛与酮的耦合产物，在生物合成黄酮类衍生物 中作为中间体。查尔酮因为生物活性广谱性引起我们很大的兴趣，所以最近我们报道了查 尔酮的潜在药理和生物学特性。查尔酮的抗癌潜力激发了我们寻找以查尔酮为基础新抗癌 药物的兴趣。查尔酮的细胞毒活性与干扰微管形成和微管蛋白抑制密切相关，这在细胞过 程中很重要，像细胞复制，细胞质和细胞器运动，有丝分裂和细胞形状的调控。
[0006] 查尔酮作为有前景的抗癌剂和酪氨酸酶抑制剂，促使我们评估一系列合成的查尔 酮和吡唑啉对人癌细胞系和蘑菇酪氨酸酶二酚酶活性的抑制作用。
【发明内容】
[0007] 本发明目的在于提供一系列吡唑啉衍生物，其具有酪氨酸酶抑制作用和抗肿瘤生 物活性，适合用作酪氨酸酶抑制剂和预防或治疗肿瘤疾病的药物。
[0008] 为达到上述目的，采用技术方案如下：
[0009] 吡唑啉衍生物，具有以下结构式：
[0010]
[0011] 上述结构式中，R代表以下基团：
[0012]
[0013] R1, R2, R3, R4, R5各自独立是氢原子、甲氧基或二甲基胺。
[0014] 按上述方案，所述吡唑啉衍生物为：
[0015] 1-(2,3-二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基）-3-(4-二甲基氨 基-萘-1-基）-丙烯酮（4)、
[0016] 3-苯并呋喃-2-基-5- (4-二甲基氨基-萘-1-基）-4, 5-二氢-吡唑-1-硫代甲 酸酰胺（Ia)、
[0017] 3-苯并呋喃-2-基-5- (4, 7-二甲氧基萘-1-基）-4, 5-二氢-吡唑-1-硫代甲酸 酰胺（2a)、
[0018] 3-(2,3_二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基）-5-(4-二甲基氨 基-萘-1-基）-4, 5-二氢-吡唑-1-硫代羟酸酰胺（4a)、
[0019] 3-苯并呋喃-2-基-5- (4-二甲基氨基-萘-1-基）-4, 5-二氢-吡唑-1-羧酸 (4-氯苯基）-酰胺（Ib)或
[0020] 3-(2,3_二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基）-5-(4-二甲基氨 基-萘-1-基）-4, 5-二氢吡唑-1-羧酸（4-氯-苯基）-酰胺（4b)。
[0021] 上述吡唑啉衍生物作为酪氨酸酶抑制剂的应用。
[0022] 上述吡唑啉衍生物作为预防或治疗恶性肿瘤药物的应用。
[0023] 本发明具有有益效果如下：
[0024] 本发明将查尔酮和氨基硫脲两类化合物结合设计合成了一类新型吡唑啉衍生物， 并为药物的设计以及合成提供了一种有价值的方法。
[0025] 首次测定该系列化合物的生物活性，证实本发明合成的化合物具有酪氨酸酶抑制 作用和抗肿瘤生物活性，适合用作酪氨酸酶抑制剂和预防或治疗肿瘤疾病的药物，具有较 好的潜在应用前景。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例进一步阐释本发明的技术方案，但不作为对本发明保护范围的限制。
[0027] 本发明吡唑啉衍生物制备过程如下：
[0028] 将相等摩尔量的酮和醛在碱性条件下用Claisen-Schmidt缩合反应合成查尔酮 (1-6)〇
[0029] 将查尔酮（1-6)和硫代氨基脲在碱性条件下反应，得到吡唑啉衍生物（la_6a)。
[0030] 用相同的反应，在碱性条件下将查尔酮（1-6)和N-(4_氯苯基）氨基脲反应，合成 P比挫啉衍生物（lb_6b)。
[0031] 所有合成的化合物通过重结晶技术或柱色谱来纯化。成功合成的新化合物由质 谱，13C-NMR, 1H-NMR和元素分析来确认。
[0032]
[0033]
[0034] 对合成的所有化合物用L-DOPA作底物进行酪氨酸酶抑制作用检测，用曲酸（5-羟 基-2-(羟甲基）_4氢-吡喃-4-酮）作阳性对照。吡唑啉衍生物和取代查尔酮对酪氨酸 酶的IC50值概括在表1中，IC50值为三个实验的平均值。结果见表1所示。
[0035] 表 1
[0036]
[0037]
[0038] 结果表明，大多数化合物显示出对蘑菇酪氨酸酶有效的抑制作用，各个IC50值在 4. 72-87. 24 μ M范围内变化。化合物lb-6b有4-氯苯基氨基脲表现出比其它化合物更有效 的抑制活性。此外，化合物la，4a，Ib和4b显示比阳性对照品曲酸更强的抑制活性，4b显示 了最有效的酪氨酸酶抑制活性，IC50值为4. 72 μM。
[0039] 相比于查尔酮，吡唑啉衍生物显示更有效的抑制活性。大多数查尔酮类似物对酪 氨酸酶显示出弱的抑制活性。此外，该组氨基硫脲和4-氯苯基氨基脲在提高对酪氨酸酶抑 制活性起重要作用。这可能与酪氨酸酶结构有关，在催化核心有一个3个铜的中心和耦合 双核铜活性位点。化合物la_6a的酪氨酸酶抑制作用依赖于硫原子与活性位点双核铜的螯 合能力，酪氨酸酶在形成复合物后将失去其催化能力。观察发现含杂环化合物如4, 4a和4b 比含不同环系统的1，Ia和Ib化合物有更高的抑制活性。
[0040] 实施例1
[0041] 化合物1-(2,3_二氢-苯并[1，4]二氧杂环己烯-6-基）-3-(4-二甲基氨 基-萘-1-基）_丙烯酮⑷的合成：
[0042] 将1-(2, 3-二氢苯并[b] [1，4]二氧杂环己稀-6-基）乙酮（I. 78g, IOmml)加入 到4-二甲胺-1-萘醛（1.99g, IOmml)的乙醇溶液（15ml)中。在反应混合物中逐滴加入 50%的NaOH溶液成碱性（PH= 10)，反应混合物在27°C下搅拌8个小时。TLC监测反应完 成。将反应液倒入50ml的盐酸冰水混合物中（Iml浓盐酸）。用乙酸乙酯（50ml)萃取，加 水（150ml)洗涤，用无水硫酸镁干燥，旋转蒸发仪浓缩，得到淡黄色粉末1-(2,3_二氢-苯 并[1，4]二氧杂环己烯-6-基）-3-(4-二甲基氨基-萘-1-基）-丙烯酮（4)1. 76g，产率 49%〇
[0043] 1H NMR (500MHz，CDCl3) δ : 7. 78 (d，J = 8. 5Hz，H)，7. 66 (d，J = 7. 0Hz，H)，7. 56 (d，J =7. 3Hz, H), 7. 41 (d, J = 6. 0Hz, H), 7. 37-7. 31 (m, J = 8. 0Hz, 3H), 7. 15 (s, H), 7. 12 (d, J =8. 0Hz, H) , 6. 82 (d, J = 8. 5Hz, H) , 6. 6 I (d, J = 7. 5Hz, H) , 5. I 2 (m, J = 8. 4Hz, 4H), 3. 72 (s, 6H) ；13C NMR(DMS〇-d6) δ ：32. 2, 32. 8, 82. 2, 82. 6, 111. 3, 118. 2 ,119. 6, 123. 5, 124. 3, 126. 3, 127. 2, 128. 2, 128. 8, 129. I, 129. 5, 132. 4, 133. 4, 13 7. 3, 146. 5, 148. 8, 152. 4, 154. 6, 190. 2. Mass Spectrum (ESI) m/z : 382. 62 [M+Na]+ ； Microanalysis Calculated for C23H21NO3 (359. 42), C, 76. 86% ；H, 5. 89% ；N, 3. 90% . Found C:77. 12% ,H:5. 98% ,N:3. 98% .
[0044] 实施例2.化合物3-苯并呋喃-2-基-5-(4