从白刺种子中提取分离MTCA及其ss、rs两种构象的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从白刺种子中同时提取分离两种手性生物碱的方法。
【背景技术】
[0002] 白刺种子中含有多种活性成分，目前从白刺种子中分离得到了很多活性物质，主 要有以下几类物质，黄酮类：槲皮素、异鼠李素-7-Ο-α-L-鼠李糖甙、山奈素-7-Ο-α-L-鼠 李糖甙、异鼠李素-7-Ο-β-D-葡萄糖甙、槲皮素-7-0-a-L-鼠李糖甙、异鼠李糖、尿囊 素、胡萝卜苷、异鼠李糖；生物碱类：L-色氨酸、尿囊素和1-甲基-1，2,3,4-四氢-β -咔 啉-3-羧基酸（l-Methyl-l，2, 3,4_tetrahydr〇- β -carboline-3-carboxylic acid，简称 MTCA)〇
[0003] MTCA属于吲哚类生物碱，目前吲哚类生物碱的研宄已成为抗肿瘤药物活性的热 点。特别是在新药及其新药先导化合物发现中起着不可替代的作用。吲哚类生物碱抗肿瘤 成分主要对卵巢癌、淋巴癌和消化道系统癌如肝癌、结肠癌等有较显著的疗效。此外，吲哚 类生物碱抗肿瘤成分在诱导肿瘤细胞分化、促进肿瘤细胞凋亡以及提高机体免疫方面亦表 现出一定的作用。MTCA活性实验表明MTCA具有较强的清除羟基自由基的能力，在细胞浓度 低于30 μ g/mL时对人表皮细胞Hucat时有一定的促进作用，同时对人肝癌细胞7221细胞 有促进凋亡的作用。
[0004] 研宄表明MTCA广泛的存在于食品中如小麦、黑麦面粉、大豆蛋白、牛乳以及酒精 饮料如啤酒和红酒中。从食品、酒精饮料以及生物样品分离出来的MTCA通常会包括两种类 型（1S，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸（简称 ssMTCA)和（1R，3S)-1-甲 基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸（简称rsMTCA)。在两个MTCA的非对映体中，ssMTCA 的含量是rsMTCA含量的四倍之多。对两种异构体的提取分离研宄，可以为更好地认识各异 构体药理活性打下基础。
[0005] 之前对其中的单一化合物即SSMTCA的分离主要是通过硅胶柱结合葡聚糖凝胶 LH-20和RP-18柱纯化得到或者是通过液液提取结合固相微萃取与离子交换获得。但目前 还未见使用高速逆流色谱从白刺种子中提取分离ssMTCA的研宄报道，更未见从白刺种子 中提取分离rsMTCA的方法。
[0006]
【发明内容】
[0007] 高速逆流色谱（High-speed counter-current chromatography，简称HSCCC)分离 技术是一种连续高效的液-液分配色谱分离技术，它不用任何固态的支撑物或载体，利用 两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相 作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相，物质的分离依 据其在两相中分配系数的不同而实现，特别适合于天然产物活性成分的分离。
[0008] 本发明的目的就在于提供一种利用HSCCC技术从白刺种子中同时提取分离 ssMTCA 和 rsMTCA 的方法。
[0009] 具体地，本发明提供了从白刺种子中提取分离（1S，3S)、（1R，3S)两种构型的1-甲 基-1，2, 3,4_四氢-β-咔啉-3-羧基酸的方法，它包括如下操作步骤：
[0010] (1)粗提物的制备：
[0011] 取白刺种子，以乙醇为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行 萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10% V/V乙醇溶洗脱，收集10% V/V乙醇洗脱 液，浓缩、干燥即得粗提物；
[0012] (2)采用高速逆流色谱法分离：
[0013] 取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为 固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液； 以20~40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度25~30°C，主机 正向旋转，转速为800~1000r/min，以1. 5~3. OmL/min的速度泵入流动相，待流动相从 管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254~280nm波长下进行检测，收集出峰时间 300~350min的成分，即得初步纯化物；
[0014] (3)半制备液相色谱分离：
[0015] 取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254~280nm下检测，依次收集第一和第 二大色谱峰洗脱部位，除去溶剂即可分别得到（1S，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氢-β-咔 啉-3-羧基酸、（1R，3S)-1-甲基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸，色谱条件如下：
[0016] 流动相：甲醇-水=(25~30) : (75~70)。进一步地，步骤⑴中，提取所用 乙醇的浓度为65 %~95 %，进一步为70 %~80 %，优选为75 % V/V。
[0017] 步骤⑵中制备的初步纯化物即为1-甲基-1，2, 3,4_四氢-β-咔啉-3-羧基 酸，ss和rsMTCA的混合物。本发明一个【具体实施方式】中，1-甲基-1，2, 3,4_四氢-β -咔 啉-3-羧基酸的纯度达到了 97. 20%，在95%以上。
[0018] 进一步地，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂，优选使用DlOl树脂。
[0019] 进一步地，步骤（2)中，固定相的流速为30mL/min，温度为30°C，主机转速为900r/ min，流动相的流速为I. 7mL/min。
[0020] 本发明实验中对影响分离效果的其它主要因素如主机转速、流动相流速、以及水 浴温度进行了选择与优化。结果表明，低的进样量、高主机转速和低流动相流速可以改善分 离的效果，提高固定相的保留率，但相应的会增加分离所需要的时间。水浴温度的增高可以 降低分离所需要的时间，因此最终确定的分离条件为：流动相流速为I. 7mL/min，主机转速 为 900rpm/min，温度为 30°C。
[0021] 进一步地，步骤（2)、（3)中，检测波长为254nm。
[0022] 本发明半制备色谱中，甲醇浓度高会导致分离速度快，保留时间短，但分离效果不 理想。甲醇浓度低可以改善样品的分离效果，但分离速度相应缩短，分离时间延长。因此综 合考虑，本实验采用30%甲醇等度洗脱，即流动相为甲醇-水=30 : 70。
[0023] 本发明还提供了从白刺种子中分离纯化1-甲基-1，2, 3,4_四氢-β-咔啉-3-羧 基酸的方法，它包括如下操作步骤：
[0024] (1)粗提物的制备：
[0025] 取白刺种子，以乙醇为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行 萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10% V/V乙醇溶洗脱，收集10% V/V乙醇洗脱 液，浓缩、干燥即得粗提物；
[0026] (2)采用高速逆流色谱法分离：
[0027] 取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为 固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液； 以20~40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度25~30°C，主机 正向旋转，转速为800~1000r/min，以1. 5~3. OmL/min的速度泵入流动相，待流动相从 管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254~280nm波长下进行检测，收集出峰时间 300~350min的成分，除去溶剂即得1-甲基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸。
[0028] 上述方法制备的1-甲基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的纯度在95%以 上。本发明一个【具体实施方式】中，其纯度为97. 20%。
[0029] 本发明利用高速逆流色谱并采用了合理的溶剂体系从白刺种子中同时提取分离 得到了高纯度的1-甲基-1，2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸和ssMTCA、rsMTCA，该技术 不需要使用固相载体，无不可逆吸附，样品损失小、无污染、高效、快速、低成本。本发明工艺 简单、操作方便、安全、重复性好，可工业化生产。
【附图说明】
[0030] 图1本发明逆流色谱图
[0031] 图2本发明化合物的半制备色谱图
[0032] 图3本发明目标化合物ssMTCA的HPLC图谱
[0033] 图4初步纯化物的HPLC图谱
[0034] 图5本发明目标化合物rsMTCA的色谱图
[0035] 本发明图谱中，标注为数字"2"的色谱峰为ssMTCA，标注为数字"3"的色谱峰为 rsMTCA〇
【具体实施方式】
[0036] 实施例1 :
[0037] 1、粗提物制备
[0038] 白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以I : 10kg/L的料液比进行提 取，提取时间2h，提取溶剂75%的乙醇，提取次数为3次。3次提取后将提取溶液合并，回收 乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓 缩蒸干，加水溶解，上DlOl大孔树脂进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度 依次是：水、10% V/V乙醇溶液，收集10%乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干备用。
[0039] 2、采用高速逆流色谱法分离：
[0040] 取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为 固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液； 以30mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度30°C，主机正向旋转， 转速为900r/min，以I. 7mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后， 注入样品溶液，在254nm波长下进行检测，收集出峰时间300~350min的成分，即得初步纯 化物（逆流色谱图见图1);
[0041] 3、半制备液相色谱分离：
[0042] 取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254nm下检测，依次收集第一大峰和第二大 峰（制备色谱图见图2)，除去溶剂即可同时得到ssMTCA和rsMTCA，色谱条件如下：
[0043] 流动相：甲醇-水：30 : 70。
[0044] 实施例2 :
[0045] 1、粗提物制备
[0046] 白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以I : 15kg/L的料液比进行提 取，提取时间3h，提取溶剂65%的乙醇，提取次数为3次。3次提取后将提取溶液合并，回收 乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓 缩蒸干，加水溶解，上DlOl大孔树脂进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度 依次是：水、10% V/V乙醇溶液，收集10%乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干备用。
[0047] 2、采用高速逆流色谱法分离：
[0048] 取正丁醇：0.5%甲酸=5 : 6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为 固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液； 以20mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度30°C，主机正向旋转， 转速为800r/min，以I. 5mL/min的速度泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后， 注入样品溶液，在280nm波长下进行检测，收集出峰时间3