一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种无血清培养基，属于生化领域。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞由于具有良好的自我增殖能力和多向分化潜能，在体内和体外特定 条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种 成体细胞分化的能力。已有的研宄表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且 易于外源基因导入表达，因此可作为组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治 疗中重要的载体细胞，在造血干细胞移植和器官移植中也具有广泛的应用前景。
[0003]由于存在上述需要，如何大规模的培养和繁殖间充质干细胞是本领域目前关注的 热点问题之一。常规的技术方案是在实验室条件下，向培养基中添加胎牛血清使其得到有 效培养。这样的培养方式会影响细胞增殖效率及生物学性能，而且存在动物血清质量不佳 导致的病毒污染风险，造成细胞制品的异种蛋白污染。
[0004] 针对以上问题，本领域提出的一种解决方案是在将人间充质干细胞培养到最后 1~2代时，将含胎牛血清培养基替换成无血清培养基，但残留的异种蛋白污染始终存在， 无法彻底去除；另一种解决方案是全程培养采用无血清培养基，这就要无血清培养基中具 有足够的营养物质以维持细胞的良好生长，导致高品质的人间充质干细胞无血清培养基的 成本极高，同时一旦营养成分配比设计不合理就会使得干细胞培养失控，使得其难以大规 模产业化应用，也难以调控人间充质干细胞制品的品质。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的存在的问题，申请人对人间充质干细胞的培养问题进行了深入研 宄，从而发明了一种无血清培养基，通过改进其中的各组分用量和类型，为人间充质干细胞 的生长培养提供充足的营养，同时保证其良好的品质。
[0006] 具体的说，本发明是通过如下技术方案实现的：
[0007] -种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基，以DMEM培养液作为基础培养 基，在DMEM培养液中加入有全营养组分：氨基酸、维生素、蛋白营养素、无机盐；调控组 分：糖代谢激素、生长因子、抗氧化剂，各成分的用量为在lml的DMEM培养液中，糖类代谢 激素10-20yg、氨基酸120-250yg、生长因子200-500ng、维生素40-100ng、蛋白营养素 500-1200ng、抗氧化剂 100-180yg、无机盐 8-35mg。
[0008] 通过上述组成，利用全营养组分保证人间充质干细胞的良好成长和繁殖，提供其 培养所需各种元素；同时，所添加的调控组分能够对培养的人间充质干细胞增殖速度进行 调整，防止过度增长影响所得人间充质干细胞制品的品质。
[0009] 其中，所用的氨基酸包含细胞生长所需的氨基酸至少包含一种或几种必需氨基 酸，和一种或几种半必需氨基酸，以便为其具有良好的活性，且使干细胞在营养平衡状态下 进行多代扩增而不发生分化。优选所用氨基酸的组成为必需氨基酸包括苏氨12-15yg、亮 氨酸24-30yg、异亮氨酸18-22yg、赖氨酸9-14yg、蛋氨酸30-40yg;半必需氨基酸包括 甘氨酸8-14yg、精氨酸9-16yg、丝氨酸30-35yg、酪氨酸28-35yg。
[0010] 其中，所用的维生素在所给定的浓度范围内能够提高干细胞的增殖能力，与生长 因子中间产生协同作用增加生长因子对干细胞的增殖效应。其中，所用维生素优选如下：叶 酸 20_55ng、d-泛酸妈 17_23ng、氯化胆碱 3-10ng、维生素B12 3-10ng、肌醇l_5ng。
[0011] 其中，所用的蛋白营养素能够保持干细胞增殖过程中的活力，优选其组成如下：重 组人转铁蛋白15-40ng、腐胺20-25ng、重组人血清白蛋白500-1100ng。
[0012] 其中，所用的无机盐为干细胞增殖生长提供基本的生存环境，所用无机盐提供 干细胞保持其活性所需的离子环境。优选的，所述无机盐包括氯化钙33-40yg、氯化钾 70-300yg、氯化钠10-30mg、柠檬酸铁0. 8-1yg。在该用量下，提供较为理想的pH环境。
[0013] 在本发明中，为了实现人间充质干细胞的生长增殖最优化，使用了多种调节成分 对其进行微调。下面就各调节成分的作用进行详细说明。
[0014] 其中，所用的糖类代谢激素以胰岛素为主要成分，辅之以胰岛素反调节激素，胰岛 素的用量为12-15yg，胰岛素反调节激素的用量为50-600ng。
[0015] 在上述中，使用胰岛素能够促进干细胞的生长，刺激干细胞生长过程中的增殖；使 用胰岛素反调节激素用来抑制胰岛素的副作用（胰岛素的使用会略微促进干细胞凋亡）。
[0016] 其中，所用的胰岛素反调节激素可以采用常见的类型，包括但不限于生长激素、皮 质醇。
[0017] 在本发明中，所用的生长因子用来促进干细胞贴壁，促进其增殖纯化。优选的，生 长因子包括内皮细胞生长因子80-260ng、成纤维细胞生长因子100-150ng、肝细胞生长因 子 40_75ng〇
[0018] 在本发明中，所用抗氧化剂能有效抑制干细胞增殖过程中的凋亡现象。优选的，抗 氧化剂包括谷胱甘肽90-130yg、维生素C10-13yg、维生素E10-15yg。
[0019] 在本发明的无血清培养基中，为了防止pH环境设置不当对干细胞增殖的影响，本 发明的血清培养基中还加入有pH指示剂，其用量为0. 1-0. 5mg。
[0020] 通过添加pH指示剂，能够确认培养基溶液的酸碱性。由于合理的生长环境要求偏 中性，因此上述pH指示剂优选为酚红。
[0021] 在上述技术方案的基础上，本发明还公开了一种用于培养人间充质干细胞的无血 清悬浮培养基，能够使细胞保持悬浮状态并良好生长，消除贴壁生长的机械应力影响，使人 间充质干细胞制剂能够获得更好的活性。为实现上述目的，是在前述无血清培养基中加入 表面活性剂和/或微载体作为悬浮载体，悬浮载体的用量为0. 5-5mg。
[0022] 为了最佳化匹配本发明培养基的组成，上述所用的表面活性剂优选聚氧乙烯-聚 氧丙烯共聚物、微载体优选Cytodex?。添加上述表面活性剂或微载体的培养基能够在3D立 体空间内培养细胞，使细胞生长环境更符合其在生物体内生理状态下的环境。
[0023] 申请人进行的实验显示，本发明的无血清培养基通过合理添加营养物质，并复之 以调节组分，在低成本的前提下得到了培养效果极为接近胎牛血清培养基的无血清培养 基，使用该培养基能够在间充质干细胞传代至2代时即可换用无血清培养，传代至4到6代 所得的干细胞制剂无任何胎牛血清残留。
【附图说明】
[0024] 图1为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞至5代的干细胞分布形态示 意图；
[0025] 图2为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞至5代的干细胞分布图中非 均匀区域所占面积分布；
[0026]图3为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞2-6代培养中细胞倍增时间 DPT变化趋势图；
[0027] 图4为采用本发明无血清培养基增殖人间充质干细胞早期和晚期的细胞活性变 化图。
【具体实施方式】
[0028] 在下述实施例中，申请人提供了本发明培养基应用于人间充质干细胞增殖的若干 具体实现及其效果。如下所提供的实施仅是示意性的，并不对本发明构成特别限定。本领 域技术人员在理解和掌握本发明实质精神的基础上对各成分类型和用量进行的合理调整 依旧属于本发明的保护范围。
[0029] 实施例1
[0030] 在本实施中，提供了本发明无血清培养基的若干具体实现，并初步以人骨髓间充 质干细胞BM-MSC研宄其在各种组合条件下的干细胞生长增殖情况。
[0031] 组成1 :在每lml的DMEM培养液中含有生长激素50ng、皮质醇20ng、胰岛素12yg、 甘氨酸8 y g、精氨酸9 y g、苏氨酸12 y g、丝氨酸30 y g、亮氨酸25 y g、异亮氨酸18 y g、 L_赖氨酸9 y g、蛋氨酸30 y g、L-酪氨酸28 y g、内皮细胞生长因子100ng、成纤维细胞 生长因子l〇〇ng、肝细胞生长因子40ng、叶酸30ng、d-泛酸妈17ng、氯化胆碱3ng、维生素 B12 3ng、肌醇lng、重组人转铁蛋白15ng、腐胺20ng、重组人血清白蛋白500ng、谷胱甘肽 95 y g、维生素C 10 y g、维生素E 10 y g、氯化钙35 y g、氯化钾70 y g、氯化钠10mg、柠檬酸 铁 〇? 8 y g。
[0032] 组成2:在每1ml的DMEM培养液中含有生长激素200ng、皮质醇25ng、胰岛素 14 yg、甘氨酸12yg、精氨酸12yg、苏氨酸12yg、丝氨酸35yg、亮氨酸27yg、异亮氨酸 20yg、L-赖氨酸10yg、蛋氨酸35yg、L-酪氨酸30yg、内皮细胞生长因子200ng、成纤维 细胞生长因子120ng、肝细胞生长因子60ng、叶酸40ng、d-泛酸妈20ng、氯化胆