一种灰绿霉素与绿灰霉素高产菌株及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种灰绿霉素与绿灰霉素高产菌株及 其构建方法。
【背景技术】
[0002] 灰绿霉素和绿灰霉素是一组分属A型与B型的链阳菌素，其中绿灰霉素又称为宜 他霉素（etamycin)(图1)。灰绿霉素与绿灰霉素具有显著的协同抗菌效应，能够治疗一些 极端抗药菌和耐药菌引发的严重感染，应用前景巨大。因此通过提高目标生产菌灰绿霉素 和绿灰霉素的产量，获得更多的灰绿霉素和绿灰霉素纯品，一方面可以充实化合物库，促进 生物学和化学研宄工作；另一方面也为成药性开发提供坚实的物质基础。
[0003] 本研宄团队前期已经鉴定了陆生灰绿链霉菌Streptomyces griseoviridis NRRL 2427中的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇。但是菌株自身灰绿霉素和绿灰霉素的产 量有限，如何有效提高菌株的单位产量，缩短生产周期在未来灰绿霉素和绿灰霉素推广应 用中具意义重大。同时在鉴定报道并申请专利保护的基因簇内，与灰绿霉素和绿灰霉素相 关的转运因子是否对灰绿霉素与绿灰霉素具有转运外排作用；是否影响灰绿霉素与绿灰霉 素的生物合成；是否可以应用于后续生产改良等尚不明确。有待深入研宄分析。
[0004] 与其同时，近年来发展起来的组合生物合成技术为改造复杂天然产物提供了新的 思路和方法。在阐明了自然界的生物合成途径、克隆和鉴定微生物天然产物生物合成基因 簇的基础上，采用组合生物合成技术对发现的生物合成相关基因进行体内敲除、突变、置换 和重组超表达等操作，不但能够生产"非天然"的天然产物结构类似物，尤其可以提高天然 产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的成药性开发和工业化生产应用 提供理论支持和技术基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种灰绿霉素与绿灰霉素高产菌株及其构建方法。
[0006] 本发明中S.griseoviridisNRRL2427的灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成 基因簇的DNA序列已储存在GenBank中，其注册编号为JX508597,也公开于专利号：ZL 201210284937. 7,发明名称：灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成基因簇及其应用的发明专 利中。而基因簇前期注释报道至少有三个转运蛋白的编码基因，分别是：sgvTl、sgvT2和 sgvT3(图2hsgvTl基因位于基因簇的上游，长度为1593个碱基对（其序列如SEQIDNO. 1 所示核苷酸序列的反向互补序列），编码一个含530个氨基酸残基的majorfacilitator superfamily(MFS)家族转运蛋白（NCBI索引号AGN74873.1) ;sgvT2基因位于基因簇的中 间的上下游分割点，长度为1656个碱基对（其序列如SEQIDN0. 2所示），编码一个含551 个氨基酸残基的ABC家族转运蛋白（NCBI索引号AGN74890. 1) ;sgvT3基因位于基因簇的下 游，长度为1395个碱基对（其序列如SEQIDN0. 3所示），编码一个含464个氨基酸残基的 majorfacilitatorsuperfamily(MFS)家族转运蛋白（NCBI索引号AGN74899.1)(图 3-4)。 虽然基于生物信息学的研宄，我们可以初步推测这几个蛋白的功能。但是由于放线菌中的 转运蛋白功能和机制的研宄极为有限，近年来对微生物次级代谢产物的生物合成中的抗性 及转运机制研宄，几乎全部基于生物信息学功能分析，少有直接进行功能研宄分析；此外转 运蛋白的功能往往存在功能交叉互补或不确定性，即位于一个基因簇内的转运蛋白未必能 够起到转运相应合成产物的功效或某特定代谢产物的转运蛋白实际位于基因簇外或其他 代谢途径的生物合成基因簇内。
[0007] sgvTl基因编码的SgvTl蛋白与sgvT3基因编码的SgvT3蛋白经Clustal W方法 进行的多序列比对如图3所示。sgvT2基因编码的SgvT2蛋白经Clustal W方法进行的多 序列比对如图4所示。
[0008] 本发明通过链霉菌的PCR-Targeting技术和接合转移技术构建了sgvTl、sgvT2和 sgvT3三个基因的失活突变菌株AsgvTl、ASgvT2和ASgvT3。随后通过发酵结合HPLC 分析，发现sgvTl-T2两个基因失活后，灰绿霉素和绿灰霉素的生物合成及产量受到明显 影响，其中sgvTl的产量降低非常明显，尤其是绿灰霉素的产量降低至不到野生型产量的 5%。而sgvT3基因的失活，对灰绿霉素和绿灰霉素的生产没有任何明显的影响，这表明 sgvT3功能并非灰绿霉素和绿灰霉素生物合成必需基因。随后通过构建突变菌株的反式回 补菌株AsgvTl: :sgvTl和AsgvT2: :sgvT2,结合发酵和HPLC分析，两株回补菌株均基本能 恢复灰绿霉素和绿灰霉素产量至野生型水平（图5)。
[0009] 经过S.griseoviridisNRRL2427菌株的发酵定量分析，得出其灰绿霉素的 33. 72±3. 5yg/mL而绿灰霉素的产量为32. 68±3. 5yg/mL。在突变菌株AsgvTl中，相应 数值降低为18. 07±0. 5yg/mL和1. 95±0. 22yg/mL;在突变菌株AsgvT2,相应结果则降 低为18. 16±0. 75yg/mL和17. 62±1. 2yg/mL。相应定量分析进一步验证了sgvTl-T2对 灰绿霉素和绿灰霉素生物合成的重要性。
[0010] SgvTl和SgvT2是灰绿霉素和绿灰霉素生物合成相关的转运蛋白，而且突变菌株 回补成功，证明回补片段可以在菌株内部有效表达。因此针对野生型菌株回补表达相关基 因sgvTl和sgvT2,可以有效提尚相关基因表达的拷贝数，提尚菌株细胞中特定转运蛋白的 含量，适当增加细胞膜对灰绿霉素和绿灰霉素的通透性，促进代谢产物的外排，减少代谢产 物积累造成的反馈抑制，从而有效提高灰绿霉素和绿灰霉素的产量。因此通过将sgvTl和 sgvT2基因分别克隆至带有红霉素强启动子ermE的载体pSET152AKE和pPWW50Apr中，构建 相应的克隆质粒pSET152AKE-sgvTl和pPffff50Apr-sgvT2。并通过接合转移方法导入野生型 菌株S.griseoviridisNRRL2427构建重组菌株S.griseoviridisNRRL2427: :sgvTl_T2〇 随后通过发酵结合HPLC分析，发现灰绿霉素和绿灰霉素的产量有大幅度的提升，通过定 量分析发现灰绿霉素和绿灰霉素的产量均提高约3倍，达到了 100. 25± 1. 5yg/mL和 90. 70 ±2. 0yg/mL(图6)。随后通过抗生素添加对比分析发现不论是否有抗生素筛选压力 下，构建的菌株生产稳定，产量提高显著（图7)。
[0011] 因此，本发明的第一个目的是提供灰绿链霉菌S.griseoviridisNRRL2427中超 量表达sgvTl和sgvT2基因在提高灰绿霉素与绿灰霉素产量中的应用，所述的sgvTl基因 的核苷酸序列为如SEQIDNO. 1所示序列的反向互补序列，所述的sgvT2基因的核苷酸序 列如SEQIDN0. 2所示。
[0012] 本发明的第二个目的是提供一种灰绿霉素与绿灰霉素高产菌株的构建方法，其特 征在于，是在灰绿链霉菌S.griseoviridisNRRL2427中回补表达sgvTl和sgvT2基因，而 获得灰绿霉素与绿灰霉素高产菌株，所述的sgvTl基因的核苷酸序列为如SEQIDNO. 1所 示序列的反向互补序列，所述的sgvT2基因的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0013] 优选，其是将sgvTl或sgvT2基因转入表达载体中，将此含有sgvTl或sgvT2基因 的重组表达载体一起导入灰绿链霉菌S.griseoviridisNRRL2427中，然后在灰绿链霉菌 S.griseoviridisNRRL2427中超量表达sgvTl和sgvT2基因，从而获得灰绿霉素与绿灰霉 素高产菌株。
[0014] 本发明获得了灰绿霉素和绿灰霉素的高产菌株，从而为灰绿霉素和绿灰霉素产业 化制备提供了途径。
[0015] 本发明的灰绿链霉菌S.griseoviridisNRRL2427属于现有技术中的已知 菌株，在美国专利（U.S3, 023, 204)公开过，该菌株保藏于美国农业研宄菌种保藏中心 (AgriculturalResearchServiceCultureCollection，NRRL)，保藏号为：NRRL2427。
【附图说明】：
[0016]图1是是灰绿霉素（GV)和绿灰霉素（VG)的化学结构式。
[0017]图 2 是StreptomycesgriseoviridisNRRL2427 中灰绿霉素和绿灰霉素生 物合成基因簇：Regulation/reparigenes调控和修复基因；Resistancegenes抗性基 因；Gamma-butyrolactonebiosynthesisgenesy-丁内醋类化合物生物合成基因；NRPS genesforVGbiosynthesis绿灰霉素生物合成中非核糖体肽合成酶；PKS/NRPSgenesfor GVbiosynthesis灰绿霉素生物合成中的杂合的聚酮合酶和非核糖体肽合成酶；Precursor biosyntheticgenesforVGbiosynthesis绿灰霉素生物合成前体单元生物合成基因；GV tailoringgene灰绿霉素环内C-S键催化酶；Boundary边界基因；Unknowngenes未知功 能基因。
[0018] 图3是sgvTl基因编码的SgvTl蛋白与sgvT3基因编码的SgvT3经ClustalW 方法进行的多序列比对。保守跨膜区用灰色背景标注。其中粉红色区域（箭头所指）为 SgvTl与其他蛋白结构不同而多出的两个跨膜区。所选取的代表性蛋白的物种来源及 NCBI注册号如下：CmcT(Amycolatopsislactamdurans，Q04733) ;CmcT(S.clavuligerus， WP_003952491) ;EncT(S.maritimus，AAF81738)andMctT(S.lavendulae，AAD29366)〇
[0019] 图4是sgvT2基因编码的SgvT2蛋白经ClustalW方法进行的多序列比对。保 守的结构域通过灰色背景或深色字体标