阿司匹林抵抗相关的GPⅢa基因多态性位点及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学疾病治疗药物选择领域，具体涉及阿司匹林抵抗相关的GPIIIa基 因多态性位点及应用。 技术背景
[0002] 随着我国人口老龄化，脑血管病发病率逐年攀升，最新调查结果表明从2010年起 脑血管病已成为超越肿瘤危害中国人健康的第一大杀手，每年我国新发病例200万，缺血 性脑血管病占70~80%，复发患者占27%，70%的患者留有神经功能缺损，脑血管病的高 致死率、致残率和复发率已造成了极大的社会负担和经济负担。抗血小板药物（尤其是阿 司匹林）在脑血管病的防治中起着至关重要的作用，但是目前的调查结果表明很多脑血管 病患者即使服用了抗血小板药物，仍然反复再发卒中，这种现象称为抗血小板药物抵抗。
[0003] 抗血小板药物抵抗与诸多因素相关，如脑血管病相关危险因素（性别、糖尿病、吸 烟、代谢综合征、急性冠脉综合征、既往心血管事件、肝肾功能异常、血液系统疾病等），患者 依从性或药物剂量，药物相互作用及基因多态性等。其中基因多态性是目前研宄热点。既 往研宄发现，在体内影响阿司匹林作用的多个环节的因子存在基因多态性，这种多态性直 接影响其功能，从而使得不同个体服用阿司匹林后对血小板的反应不同。据不完全统计，临 床阿司匹林抵抗的患者高达40%，但是因为影响阿司匹林作用的靶点众多，到目前为止，阿 司匹林抵抗相关的基因多态性还不确定。但是阿司匹林作为缺血性脑血管疾病二级预防的 重要药物，尽快明确阿司匹林抵抗相关基因多态性至关重要。
[0004] 血小板膜糖蛋白GPIIIa是细胞粘附受体整合素家族成员之一，血小板通过 GPIIIa与纤维蛋白、纤维连接蛋白等粘附蛋白特异性结合，参与血小板粘附和聚集。基于 申请人最近的研宄，申请人明确了一个与阿司匹林抵抗相关的GPIIIa基因多态性位点： GPIIIa(A1166C)，该位点可用于为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹林抵抗 及卒中复发率。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了阿司匹林抵抗相关的GPIIIa基因多态性位点：A1166C。 该位点位于人GPIIIa基因全长的第1166位，其碱基为A或C，携带有GPIIIa突变体1166C 等位基因的患者与野生型A1166患者相比，更易出现阿司匹林抵抗。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了检测阿司匹林抵抗相关GPIIIa基因多态性位点 A1166C的引物。
[0007] 本发明最后一个目的在于提供了基于GPIIIa基因多态性位点A1166C的引物在制 备筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒中的应用。该试剂盒可用于筛选阿司匹林抵抗患者，以便 更好的为缺血性卒中患者选择抗血小板药物，降低阿司匹林抵抗及卒中复发率。
[0008] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
[0009] 与阿司匹林抵抗相关的GPIIIa基因多态性位点，该位点是在人GPIIIa基因的1166 位发生了A-C的突变，经检测携带有GPIIIa突变体1166C的患者更容易发生阿司匹林抵 抗。基于GPIIIa基因的A1166C位点设计引物，然后对该位点进行检测。
[0010] 本发明的保护内容还包括检测阿司匹林抵抗相关GPIIIa基因多态性位点A1166C 的引物，该引物只要是基于GPIIIa基因的A1166C位点设计的引物，并能成功扩增出包括GPIIIa基因的A1166C的DNA片段的，均为本发明的保护内容。
[0011] 优选的，根据上述GPIIIa基因多态性位点A1166C设计的引物为：
[0012] 正义链：5 '-TGTCAGACACTACACTCA-3'
[0013] 反义链：5 '-GGATAATCCTAGGAAAAT-3' ；
[0014]或
[0015]正义链：5 '-TCCTGAACCTCACGGTCG-3'
[0016]反义链：5 '-AAGGATGTAGAGGTTAAT-3'；
[0017]或
[0018] 正义链：5 '-CTACGGTAGTACGTCCGA-3' ；
[0019]反义链：5'-GTCATCAGCCCCAAAGAG-3'。
[0020] 基于GPIIIa基因多态性位点A1166C的引物在制备筛选阿司匹林抵抗患者试剂盒 中的应用，包括利用GPIIIa(A1166C)位点引物对缺血性卒中患者的DNA进行检测，若检测 到携带有GPIIIa突变体1166C的患者，则该患者有更易产生阿司匹林抵抗的趋势，检测方 法包括但不限于目前已有的针对SNP位点的检测技术。
[0021] 包括利用本发明提供的GPIIIa(A1166C)位点引物，与其他阿司匹林抵抗相关的 多态性位点引物结合组成的试剂盒，对患者的DNA进行检测，来筛选更易产生阿司匹林抵 抗的患者。所述的其他阿司匹林抵抗相关的多态性位点优选为：人P2Y1基因多态性位点 (A745G)，引物：正义链：5'-CACGGGTGGCCATGTCGC-3' ；反义链：5'-TACCAGGTAAATCGAITT-3'。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有以下特点：
[0023] 1)本发明提供的GPIIIa基因多态性位点（A1166C)与阿司匹林抵抗相关，意在为 缺血性卒中患者更好的选择抗血小板药物，降低卒中复发率。
[0024] 2)本发明提供的针对检测GPIIIa基因多态性位点A1166C的引物，意在制备筛选 阿司匹林抵抗的患者的试剂盒。
【具体实施方式】
[0025] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
[0026] 实施例1:
[0027] 与阿司匹林抵抗相关的GPIIIa基因多态性位点（A1166C)的发掘：
[0028] 从卒中数据库中调取2010~2014年卒中患者数据，根据缺血性卒中诊断标准，筛 选确诊为缺血性卒中患者，并且进一步选取明确服用阿司匹林作为二级预防（二级预防是 针对已经有脑卒中症状或已发生卒中后的患者而言，这些人需要预防再次发生脑卒中）的 患者为研宄对象作为总样本（共5033人）。
[0029] 1.明确总样本中卒中复发的人数，探讨总样本中GPlIIa(A1166C)基因的多态性与 卒中复发的关系（表2);
[0030] 2.总样本中，回院复诊患者（包括已复发的和未复发的患者，共3429人），采集患 者外周血，采用VerifyNow仪器检测阿司匹林反应单元（ARU)，确定ARU彡550的人数，探讨GPIIIa(A1166C)基因的多态性与ARU彡550的关系（表1)。
[0031] 本发明实施例中，以下两种情况任意一种发生均视为发生阿司匹林抵抗：
[0032] 1.若患者服用阿司匹林期间，仍然发生卒中，则定义为阿司匹林抵抗；
[0033] 2.采用VerifyNow仪器检测阿司匹林反应单元（ARU)，如果ARU彡550,则定义为 血小板高反应性，表明这个患者存在阿司匹林抵抗。
[0034] 结果表明，服用阿司匹林进行二级预防的缺血性卒中患者中，与野生型患者相比， GPlIIa(A1166C)突变型组患者阿司匹林反应单元ARU值明显高，且ARU彡550患者人数明 显高于野生型组（表1);同时卒中复发率也明显高（表2)。
[0035] 本实施例中针对GPIIIa(A1166C)基因的多态性的检测通过以下方法实现：
[0036] 针对GPIIIa基因多态性位点（A1166C)设计引物如下：
[0037]正义链：5 '-TGTCAGACACTACACTCA-3'
[0038]反义链：5 '-GGATAATCCTAGGAAAAT-3'。
[0039] 以患者总DNA为模板，利用常规PCR进行扩增，扩增片段长度为350bp，测序，检测 扩增片段的第186个碱基。野生型患者的DNA序列为SEQ ID NO. 1所示，突变型患者的 DNA序列为SEQ ID NO. 2所示。采用该对引物扩增出的序列中第186个碱基对应GPIlia基 因中的第1166位点。
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