一种猪捷申病毒通用型荧光定量rt-pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物疫病分子检测领域，具体涉及一种猪捷申病毒的检测方法，尤其 涉及一种猪捷申病毒通用型荧光定量RT-PCR检测方法。此外，本发明还涉及检测猪捷申病 毒的引物。
【背景技术】
[0002] 猪捷申病毒（PorcineTeschovirus，PTV)是小RNA病毒科（Picornaviridae)捷 申病毒属（Teschovirus)的成员，该病毒有13个血清型，在工业化猪场广泛存在，不同的血 清型会引起猪脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、腹泻、心包炎和心肌炎等临床疾病，其中以1 型病毒引起的高致病性、高死亡率的脑脊髓炎最为严重。该病毒可同其他病毒混合感染，协 同作用，给养猪业造成巨大的经济损失。因此，对猪群中病毒感染情况的检测，是疫病预防 控制、消除猪群间相互感染的重要措施。本发明利用Genbank中1~13型猪捷申病毒的全 基因组，设计一套通用型的引物，达到快速准确检测捷申病毒的目的。
[0003] 目前，对捷申病毒的检测手段，主要是病毒分离鉴定和反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)。病毒分离鉴定是疫病诊断的经典基础方法，但也是最耗时的检测手段，对于突发 疫病的早期快速诊断无能为力，会延误疫病确诊和控制的时机。分子生物学的检测方法已 受到日益重视，RT-PCR已成为疫病诊断实验室的常规检测技术。特别是实时荧光定量PCR 的出现，对于病原的检测，大大提高了检测方法的敏感性和特异性，实现了快速、精准和可 视化，同时实现了从定性到定量的飞跃。
[0004] 在本发明之前，还没有出现涉及基于SYBR染料的猪捷申病毒荧光定量RT-PCR检 测方法的公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种通用型的高效、快速的猪捷申病毒荧光定量 RT-PCR检测方法，可用于口岸动物检疫实验室、各级兽医诊断实验室以及企业。为此，本发 明还提供用于上述方法的检测引物。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0007] 在本发明的一方面，提供的是一种基于SYBRGreenI实时荧光定量的通用型 RT-PCR方法来检测猪捷申病毒，包括下述操作步骤：
[0008] 1)样品处理：取组织样品、粪便样品或液体样品，提取核酸；
[0009] 2)设计引物，该引物序列为：
[0010] 上游引物PTVF:5' -TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3'（如SEQIDNO. 1 所示）或 其互补链；
[0011] 下游引物PTVR:5' -AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3'（如SEQIDNO. 2 所示）或 其互补链；
[0012] 3)采用步骤2)设计的引物进行荧光定量RT-PCR检测；
[0013] 4)结果判定：根据扩增的曲线、Ct值和融解温度确定检测阳性和阴性。
[0014] 作为本发明优选的技术方案，步骤1)中，所述组织样品处理步骤具体为：无菌取 组织样品，加入灭菌PBS，匀浆，取匀浆液提取核酸或-20°C保存备用；所述粪便样品处理步 骤具体为：取粪便，加入灭菌PBS，涡旋混匀，离心，取上清提取核酸；所述液体样品处理步 骤具体为：取液体样品（例如血清等）直接进行核酸提取。
[0015] 作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应体系为 20yL，包括：2倍RT-PCR缓冲液10yL，反应酶混合物0. 8yL，ROX参比染料II0. 4yL，无 RNase水5. 2yL，同时加入步骤2)设计的10ymol/L浓度上下游引物各0. 8yL和RNA模 板 2yL〇
[0016] 作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应体系在 ABI7500或ViiA7荧光PCR检测系统进行。
[0017] 作为本发明优选的技术方案，步骤3)中，所述荧光定量RT-PCR检测的反应条件 为：
[0018] 阶段 1 为反转录反应：42°C5min，95°ClOsec;
[0019]阶段II为PCR反应：95°C5sec，56°C10sec，72°C30sec，72°C收集荧光，45 个循 环；
[0020] 阶段III为融解曲线分析：95°C15sec，60°Clmin，95°C15sec，ABI仪器自动生成。
[0021] 作为本发明优选的技术方案，步骤4)中，结果判定具体为：出现扩增曲线，Ct值小 于38个循环且融解温度为86. 7±0. 17°C范围内判定结果为阳性，否则判定结果为阴性。
[0022] 在本发明的另一方面，提供一种用于检测猪捷申病毒的引物，其序列为：
[0023] 上游引物PTVF:5' -TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3'（如SEQIDNO. 1 所示）或 其互补链；
[0024]下游引物PTVR:5' -AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3'（如SEQIDNO. 2 所示）或 其互补链。
[0025] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明一种通用型猪捷申病毒荧光 RT-PCR检测方法，基于SYBR染料的通用型猪捷申病毒荧光PCR检测方法国内外尚未有报 道。该方法敏感性、特异性良好，通用性强，检测成本低廉，性价比高，检测灵敏度可达到 12copies/yL，检测时间在lOOrnin内，适用于临床样品猪捷申病毒的快速检测。
【附图说明】
[0026] 图1是本发明实施例5中质粒标准品扩增的标准曲线。
[0027] 图2是本发明实施例5中质粒标准品的扩增曲线。
[0028] 图3是本发明实施例6中用质粒标准品进行10X梯度稀释后的扩增曲线。
[0029] 图4是本发明实施例6中由图3系列稀释扩增后的融解曲线。
[0030] 图5是本发明实施例6中猪捷申病毒SYBR荧光RT-PCR方法特异性验证的结果示 意图。
[0031] 图6是图5的特异性验证试验的融解曲线。
[0032] 图7是本发明实施例7中临床样品检测时的融解曲线。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用 于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarbor LaboratoryPress, 1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。
[0034] 本发明实施例中的分子检测试剂、RNA提取试剂均为商品化试剂，特异性检测对照 用病毒为市售商品化疫苗或实验室常用参考毒株。
[0035] 实施例1引物设计：
[0036] 登陆GenBank数据库，获取数据库内全部的1~13型猪捷申病毒的全基因组序 列，利用Bioedit软件的ClustalW程序，进行全基因组序列比对，筛选该病毒基因组的保 守片段，借助BeaconDesigner软件进行引物设计和评估筛选，最后利用GenBank的BLAST 功能对引物的特异性进行筛选。引物由英维捷基（上海）有限公司合成。
[0037] 上游引物PTVF:5' -TAAGTGATAATCCTTGGAAGCTAGG-3'（如SEQIDNO. 1 所示）；
[0038] 下游引物PTVR:5' -AACTGACTATACAAAGTACAGACGG-3'（如SEQIDNO. 2 所示）； PTVF/PTVR预期扩增片段大小为384bp。
[0039] 实施例2样品处理及核酸提取：
[0040] 1、样品处理：
[0041] 组织样品：无菌取组织样品5g，加入10mL灭菌PBS，匀浆。取1. 5mL匀浆液提取核 酸或-20°C保存备用。
[0042] 奠便样品：取lg奠便，加入3mL灭菌PBS，祸旋混勾，2000g离心5min，取上清提取 核酸。
[0043] 其他液体样本，如血清等，直接用于核酸提取。
[0044] 2、核酸提取：
[0045] 采用自动化磁珠核酸提取仪（Thermofisherkingfisher)或RNA提取试剂盒 (Qiagen)提取RNA，获得RNA直接上机检测或保存在-80°C备用。
[0046] 实施例3荧光定量RT-PCR检测
[0047]1、反应体系
[0048] 采用商品化的宝生物（大连）有限公司的一步法SYBR荧光定量RT-PCR试剂盒，根 据试剂盒说明书进行反应体系的配制，以20yL体系为例，其中2倍RT-PCR缓冲液10yL， 反应酶混合物0. 8yL，R0X参比染料II0. 4yL，无RNase水5. 2yL，10ymol/L浓度引物 各0.8yL，RNA