融合多肽及使用方法
【专利说明】融合多肽及使用方法
【背景技术】
[0001] IL28B与IL28A和IL29-起代表干扰素家族的亚组（III型）。多种人细胞类 型中的病毒感染可诱导它们的表达（NatImmunol. 2003 ;4(1) :69_77.NatImmunol. 2003 ; 4(1) :63-68)，并且它们进而可以结合并通过由IL28R和IL10R2组成的异二聚体受体复合 物发出信号。由IL28B、IL28A和IL29诱导的基因的组库（r印ertoire)与由干扰素a所 诱导的基本上相同。它们当中有0AS1和MX1，这两者结合并通过由IFNAR1和IFNAR2组成 的异二聚体受体复合物发出信号（Gastroenterology. 2006 ; 131 (6) : 1887-1898)。
[0002] 由包括IL28B、IL28A和IL29在内的III型干扰素诱导的抗病毒活性已被 证实对抗脑心肌炎病毒（EMCV)、水疱性口炎病毒（VSV)、流感（Eur J Immuno 1. 2004 ; 34 (3) : 796-805. J Virol. 2006 ;80 (9) : 4501-4509)、乙型肝炎病毒（HBV)和丙型肝炎 病毒（HCV)(J Virol.2005;79(6):3851-3854)。然而，在许多细胞类型中，对III型干 扰素的抗病毒应答的幅度通常小于对干扰素a的抗病毒应答的幅度。III型干扰素 与干扰素a系统间的一个显著区别是受体分布的模式。虽然干扰素a的受体广泛 地表达，但III型干扰素受体的IL28R组分只存在于细胞的有限亚组中，包括肝细胞 (Cytokine 2005, 31，109-118)。大部分造血细胞显著缺少功能性 IL28R〇fepatology. 2006 ; 44(4) :896-906)。临床前毒理学研宄已经表明，不同于聚乙二醇化的干扰素a，聚乙二醇化 的IL29肽不诱导对骨髓干细胞集落形成的抑制或诱导外周血白细胞中的抗病毒和抗增殖 活性（Ann NY Acad Sci. 2009 ; 1182:80-87)。
[0003]全球大约有1. 5亿人慢性感染丙型肝炎病毒（HCV)，这是肝硬化、肝细胞癌和肝移 植的首要原因（WHO.丙型肝炎资料简报第164号Ofepatitis C fact sheet No. 164))。在 大多数患者中HCV被认为是可治愈的疾病。当前的最前线（topline)治疗方案包括聚乙二 醇化干扰素 a与小分子抗病毒药物如利巴韦林（Health Technology Assessment 2004 ; Vol.8:No. 39)、替拉瑞韦和波普瑞韦（Ther Adv Gastroenterol 2012 ;5(2) 139-151)的组 合。遗憾的是，采用聚乙二醇化干扰素a的治疗不总是具有良好的耐受性，从而导致较差 的患者依从性。与聚乙二醇化干扰素a相关的主要毒性包括但不限于：流感样症状，如头 痛、疲劳和虚弱；神经精神性异常，如抑郁、焦虑和易怒；且更重要的是血液系统病症，如中 性粒细胞减少症和贫血。全球约3. 5亿人慢性感染乙型肝炎病毒（HBV)。当前的治疗包括 聚乙二醇化干扰素a和小分子抗病毒药物，如拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦、替比夫定和 恩替卡韦。用聚乙二醇化干扰素a治疗HBV导致与对于HCV的毒性相类似的毒性。
【发明内容】
[0004] 因此，对于比现有疗法具有更好的耐受性和/或更有效的用于丙型肝炎以及其它 疾病的新抗病毒药物存在相当大的需求。本发明满足了这种需求并且还提供了相关的优 点。本发明涵盖修饰的人白介素28B(IL28B)和人白介素29(IL29)融合多肽。本发明还提 供了用于生产融合多肽的方法，例如在原核系统如大肠杆菌（E.coli)中。此外，本发明公 开了该融合多肽在治疗病毒感染（包括但不限于丙型肝炎、乙型肝炎和流感）、自身免疫性 疾病（包括但不限于多发性硬化）和各种类型的癌症（包括但不限于肝细胞癌）中的药学 用途。
[0005] 在一个方面，本发明提供了包含来自第一干扰素A同种型的第一片段和来自第 二干扰素A同种型的第二片段的融合多肽，其中该第一和第二片段在融合位点处融合在 一起，以形成连续的多肽，其中该融合位点包含与该第一和第二干扰素A同种型中的相应 序列相同的至少约6个氨基酸的序列。
[0006] 在一些情况下，所述融合多肽可以保留第一或第二同种型的二级结构。在一些情 况下，该融合多肽与第一或第二同种型的T-表位相比，可以缺乏任何额外的T-表位。在进 一步的情况下，该融合多肽与第一或第二同种型的B-表位相比，可以缺乏任何额外的B-表 位。
[0007] 在一些实例中，第一干扰素A同种型可以是IL29同种型。在一些实施例中，第二 干扰素A同种型可以是IL28B同种型。在进一步的实例中，第一干扰素X同种型可以是 IL29同种型且第二干扰素A同种型可以是IL28B同种型。
[0008] 在一些实例中，所述融合位点可包含与第一和第二干扰素A同种型中的相应序 列相同的至少约8个氨基酸的序列。
[0009] 在另一个方面，本发明提供了具有式I的结构的融合多肽：（S1)_(螺旋 A) - (S2)-(螺旋 C) - (S3)-(螺旋 D) - (S4)-(螺旋 E) - (S5)-(螺旋 F) - (S6) 其中： a?螺旋 D 包含与具有 IL28B(SEQ ID N0:2)的从约 V98 至 Q112 或 IL29(SEQ ID N0:1) 的从约V89至Q103的残基的片段展现出至少90%同源性的氨基酸序列； b. 螺旋 E 包含与具有 IL28B(SEQ ID N0:2)的从约 R130 至 E145 或 IL29(SEQ ID N0:1) 的从约R121至E136的残基的片段展现出至少90%同源性的氨基酸序列； c. Sl、S2、S3、S4、S5和S6中的每一个独立地是具有1至约50个氨基酸残基的间隔序 列； 且其中该融合多肽的特征在于： i. 螺旋A包含与具有IL28B(SEQ ID N0:2)的从约P27至L44的残基的片段展现出至 少95%同源性的氨基酸序列，螺旋(：包含与具有1129(3￡〇10勵 :1)的从约1?56至480的残 基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列，且螺旋F包含与具有IL29(SEQ ID NO: 1) 的从约G139至A161的残基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列；或 ii.螺旋A包含与具有IL29(SEQIDN0:1)的从约P20至L37的残基的片段展现出至少 95%同源性的氨基酸序列，螺旋C包含与具有IL28B (SEQIDN0:2)的从约R63至A87的残 基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列，且螺旋F包含与具有IL28B(SEQIDN0:2) 的从约G148至A170的残基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列；或 iii.螺旋A包含与具有IL28B(SEQ ID N0:2)的从约P27至L44的残基的片段展现 出至少95%同源性的氨基酸序列，螺旋C包含与具有IL28B(SEQ ID N0:2)的从约R63至 A87的残基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列，且螺旋F包含与具有IL29 (SEQ ID NO: 1)的从约G139至A161的残基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列；或 iv. 螺旋A包含与具有IL29(SEQ IDN0:1)的从约P20至L37的残基的片段展现出至 少95%同源性的氨基酸序列，螺旋(：包含与具有1129(3￡〇10勵 :1)的从约1?56至480的残 基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列，且螺旋F包含与具有IL28B(SEQ ID N0:2) 的从约G148至A170的残基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列；或 v. 螺旋A包含与具有IL28B(SEQ ID N0:2)的从约P27至L44的残基的片段展现出至 少95%同源性的氨基酸序列，螺旋(：包含与具有1129(3￡〇10勵 :1)的从约1?56至480的残 基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列，且螺旋F包含与具有IL28B(SEQ ID N0:2) 的从约G148至A170的残基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列；或 vi. 螺旋A包含与具有IL29(SEQ ID N0:1)的从约P20至L37的残基的片段展现出至少 95%同源性的氨基酸序列，螺旋C包含与具有IL28B (SEQ ID NO: 2)的从约R63至A87的残 基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列，且螺旋F包含与具有IL29(SEQ ID NO: 1) 的从约G139至A161的残基的片段展现出至少95%同源性的氨基酸序列。
[0010] 在一些情况下，螺旋A可以与具有IL28B (SEQ ID N0:2)的从约P27至L44的残基 的片段相同。在其它情况下，螺旋A可以与具有IL29(SEQ ID N0:1)的从约P20至L37的 残基的片段相同。
[0011] 在一些情况下，螺旋C可以与具有IL28B (SEQ ID N0:2)的从约R63至A87的残基 的片段相同。在其它情况下，螺旋C可以与具有IL29 (SEQ ID NO: 1)的从约R56至A80的 残基的片段相同。
[0012] 在一些情况下，螺旋F可以与具有IL28B(SEQ ID N0:2)的从约G148至A170的残 基的片段相同。在其它情况下，螺旋F可以与具有IL29(SEQ ID N0:1)的从约G139至A161 的残基的片段相同。
[0013] 在一些情况下，S2可进一步包含螺旋B。
[0014] 在一些情况下，所述融合多肽可进一步在与IL28B(SEQ ID N0:2)相对应的氨基酸 残基中包含至少一个修饰，其中该至少一个修饰选自dV2、dP3、dV4、dA5、dR6、dL7、dR8、G9K、 A10P、LI 1T、P12T、D13T、A14G、R15K、A20G、Q21R、Q31A、A32S、R35K、K37R、L45K、D48N、C49W、 K50S、R52S、R54P、L55V、R58G、T59N、Q64L、T88A、dD90、dT91、D92P、G96E、R114Q、T127P、 C168S、C175S、P3G、V4P、A5V、R6P、L7T 和 R8S。
[0015] 在一些情况下，所述融合多肽还可在与IL29 (SEQ ID NO: 1)相对应的氨基酸残基 中包含至少一个修饰，其中该至少一个修饰选自R14Q、L57Q、A81T、82aD、82bT、G83D、E87G、 Q105R、P118T 和 D162E。
[0016] 在一些情况下，所述融合多肽可包含融合位点，该融合位点包含与IL28B (SEQ ID N0:2)和IL29(SEQ ID N0:1)中的相应序列相同的至少约6个氨基酸的序列。在进一步的 情况下，该融合位点可包含与IL28B(SEQ ID N0:2)和IL29(SEQ ID N0:1)中的相应序列相 同的至少约8个氨基酸的序列。在一些实例中，该融合位点可包含与所述至少两种干扰素 入同种型的相应序列相同的至少约6-25个氨基酸的序列。
[0017] 在一些情况下，所述融合多肽可保留IL28B(SEQ ID N0:2)或IL29(SEQ ID N0:1) 的二级结构。在一些情况下，该融合多肽与IL28B (SEQ ID NO: 2)或IL29 (SEQ ID NO: 1)的 T-表位相比，可以缺乏任何额外的T-表位。在一些情况下，该融合多肽与IL28B(SEQ ID NO: 2)或IL29 (SEQ ID NO: 1)的B-表位相比，可以缺乏任何额外的B-表位。
[0018] 在一些情况下，所述融合多肽可展现出与IL28B(SEQ ID N0:2)或IL29(SEQ ID NO: 1)的至少90%的序列同源性。在进一步的情况下，该融合多肽可展现出与IL28B(SEQ ID N0:2)或IL29(SEQ ID N0:1)的至少95%的序列同源性。
[0019] 在一些情况下，所述融合多肽的N末端可进一步被聚乙二醇（PEG)修饰。在一些 实例中，该聚乙二醇可以是单甲氧基PEG丙醛。在一些实例中，该聚乙二醇可具有约12Kd 至40Kd的分子量。在进一步的情况下，该聚乙二醇化的融合多肽与IL28B(SEQ ID N0:2) 或IL29(SEQ ID N0:1)相比，可展现出延长的体内半衰期。
[0020] 在一些情况下，所述融合多肽与IL28B(SEQ ID N0:2)或IL29(SEQ ID N0:1)相比， 可展现增强的化学稳定性。
[0021] 在一些实例中，所述融合多肽可包含选自SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、 SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。
[0022] 在又一方面，本发明提供了表达所述融合多肽的宿主细胞。在一些情况下，该宿主 细胞可以是原核细胞。在一些实例中，该原核细胞可以是大肠杆菌。在其它情况下，该宿主 细胞可以是真核细胞。
[0023] 在一方面，本发明提供了在有需要的哺乳动物中治疗病毒感染的方法，该方法包 括向该哺乳动物施用治疗有效量的所述融合多肽。在一些情况下，该病毒感染可以由选自 乙型肝炎、丙型肝炎和流感的病毒造成。
[0024] 在另一方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗炎症的方法，该方法包括向 该哺乳动物施用治疗有效量的所述融合多肽。在一些情况下，该炎症可以是多发性硬化。
[0025] 在又一方面，本发明提供了在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括向 该哺乳动物施用治疗有效量的所述融合多肽。在一些情况下，该癌症可选自结肠癌、黑素瘤 和肝细胞癌。
[0026] 在一方面，本发明提供了包含所述融合多肽中的至少一种和药学上可接受的赋形 剂的药物组合物。
[0027] 在另一方面，本发明提供了包含所述融合多肽中的至少一种和第二治疗剂的药物 组合物。
[0028] 在又一方面，本发明提供了包含编码所述融合多肽的多核苷酸的载体。
[0029] 在进一步的方面，本发明提供了产生所述融合多肽的方法，该方法包括在适于蛋 白质表达的条件下在细胞中表达所述载体，从而产生所述融合多肽。
[0030] 通过下列详细描述，本公开内容的其它方面和优点对本领域技术人员而言将会变 得显而易见，详细描述中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将会意识到的， 本公开内容能够具有其它和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行 修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和说明书本质上将被视为说明性的而不是 限制性的。 援引并入
[0031] 本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如 同特别地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
【附图说明】
[0032] 本发明的新颖特征特别地在所附权利要求书中阐述。通过参考以下对其中利用了 本发明的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述及其附图，将会获得对本发明的特征 和优点的更好的理解，在附图中：
[0033] 图1说明了使用本发明的方法进行融合多肽（SEQ ID N0:8)的蛋白质表达后的 SDS-PAGE 分析。
[0034] 图2说明了使用本发明的方法进行融合多肽（SEQ ID N0:12)的蛋白质表达后的 SDS-PAGE 分析。
[0035] 图3说明了使用本发明的方法进行融合多肽（SEQ ID N0:8)的重折叠和纯化后的 SDS-PAGE 分析。
[0036] 图4说明了使用本发明的方法进行融合多肽（SEQ ID N0:12)的重折叠和纯化后 的SDS-PAGE分析。
[0037] 图5说明了使用本发明的方法进行融合多肽（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID 勵:7、5￡〇10勵：11、5￡〇10勵：12和5￡〇10勵：13)的^末端聚乙二醇化和5?-即纯化 后的SDS-PAGE分析。
[0038] 图6说明了融合多肽（SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15)在C168巯基部分处的聚 乙二醇化后的SDS-PAGE分析。
[0039] 图7说明了在用参考IL29蛋白质（SEQ ID N0:1)和四种IL28B/IL29融合多肽 (SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:12)处理后 12 小时，在 Ifep G2 细 胞中的Mx的剂量依赖性诱导。
[0040] 图8说明了在用参考IL29蛋白质（SEQ ID N0:1)和四种IL28B/IL29融合多肽 (SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:12)处理后 12 小时，在 Ifep G2 细 胞中的〇AS的剂量依赖性诱导。
[0041] 图9说明了在用10ng/mL的参考IL29蛋白质（SEQ ID N0:1)和四种IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 12)处理后，在 H印 G2 细胞中的Mx的时间依赖性诱导。
[0042] 图10说明了在用10ng/mL的参考IL29蛋白质（SEQ ID NO: 1)和四种IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 和 SEQ ID NO: 12)处理后，在 H印 G2 细胞中的〇AS的时间依赖性诱导。
[0043]图 11 说明了在参考 IL29(SEQ ID N0:1)和 IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID N0:12) 的变性后，Mx-诱导的损失。
[0044]图 12 说明了在参考 IL29(SEQ ID N0:1)和 IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID N0:12) 的变性后，0AS-诱导的损失。
[0045]图 13 说明了参考 IL29 肽（SEQ ID NO: 1)、IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID N0:12 和 SEQ ID NO: 3)、修饰的 IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17)和 N-末 端聚乙二醇化的修饰的IL28B/IL29融合多肽（SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17)的Mx诱导 性质。
[0046]图 14 说明了参考 IL29 肽（SEQ ID N0:1)、IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID N0:12 和 SEQ ID NO: 3)、修饰的 IL28B/IL29 融合多肽（SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO: 17)和 N-末 端聚乙二醇化的修饰的IL28B/IL29融合多肽（SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17)的Mx诱导 性质。
[0047] 图15说明了聚乙二醇化的干扰素a2b(派罗欣（Pegasys))、参考N-末端聚乙二醇 化的IL29肽（SEQ ID NO: 1)、N-末端聚乙二醇化的修饰的IL28B/IL29融合多肽（SEQ ID NO: 16)和N-末端聚乙二醇化的修饰的IL28B/IL29融合多肽（SEQ ID NO: 17)的HCV复制 抑制性质。
[0048] 图16说明了 H3N2感染的A549细胞在96孔板中的多种处理条件。
[0049] 图17说明了依循多种处理条件对A549细胞的H3N2感染的抑制。 发明详沭
[0050] 在描述本发明的实施方案之前，应当理解，这些实施方案仅通过举例给出，并且本 文所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。本领域技术人员在不脱离本 发明的情况下将会想到许多变化、改变和替换。
[0051] 除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域 的普通技术人员普遍理解的相同。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可用于实施或 测试本发明，但下文仍描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以本专利说明书（包括 定义）为准。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，并非旨在进行限制。本领域技术人员 在不脱离本发明的情况下将会想到许多变化、改变和替换。
[0052] 如在本说明书和权利要求书中所用，单数形式"一种"、"一个"和"该"包括复数指 代，除非上下文另有明确规定。
[0053] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，指的是任何长度的氨基酸聚 合物。该聚合物可以是线性的或分支的，它可以包括修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸 打断。该术语还涵盖已通过例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作 (例如与标记组分的偶联）而修饰的氨基酸聚合物。
[0054] 术语"氨基酸"是指天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，包括但不限于D或L 旋光异构体，以及氨基酸类似物和拟肽。标准的单字母或三字母代码用来指称氨基酸。
[0055] 术语"天然的L-氨基酸"意指甘氨酸（G)、脯氨酸（P)、丙氨酸（A)、缬氨酸（V)、 亮氨酸（L)、异亮氨酸（I)、甲硫氨酸（M)、半胱氨酸（C)、苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸 (W)、组氨酸（H)、赖氨酸（K)、精氨酸（R)、谷氨酰胺（Q)、天冬酰胺（N)、谷氨酸（E)、天冬氨 酸（D)、丝氨酸（S)和苏氨酸（T)的L旋光异构体形式。
[0056] 用于序列并在本文中使用的术语"非天然存在的"意指与在哺乳动物中发现的野 生型或天然存在的序列不具有对应物、不互补或者不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序 列。例如，当适当比对时，与天然序列相比，非天然存在的多肽或片段可享有不超过99%、 98%、95%、90%、80%、70%、60%、50%或甚至更低的氨基酸序列同一性。