使用厌氧微生物的互养共培养物从合成气生产n-丁醇的方法
【专利说明】使用厌氧微生物的互养共培养物从合成气生产n- 丁醇的 方法 发明领域
[0001] 本发明提供了用于使用厌氧微生物的互养共培养物从合成气生产n- 丁醇和其他 含有C4的产物的方法和系统。
[0002] 发明背景
[0003] 丁醇是重要的工业化学物质，具有广泛应用。其可以用作发动机燃料，特别地与 其可以全部比例添加的汽油组合。异丁醇也可以用作甲基叔丁基醚（MTBE)的前体。当前 n- 丁醇的世界生产是350万吨/年（77亿lb/年）。此外，正在开发和证明将醇转化为适于 飞机燃料使用的长链线性径，这可以进一步增加对n-丁醇的需求（The Naval Air Warfare Center-Weapons Division, (2012)Cobalt 和 Abermarle)。对于许多国家，已经在酿酒酵 母的帮助下将单糖发酵为丁醇。将碳水化合物发酵为丙酮、丁醇和乙醇（ABE)是已知的 并且从约1915至1955在世界范围内商业实践（Beesch，S.C. (1953)A Microbiological process Report-Applied Microbiology, 1,85-95)。随着石油化学方法的来临和低成本石 化原料，基于碳水化合物的方法变得没有吸引力并且终止。
[0004] ABE方法的进一步开发和现代化由若干个组织承担。在1980年中期，Corn Products Corporation开发了非孢子性生殖的菌株和多步发酵方法，其相当地提高 了 方法的经济学（Marlatt，J. A?和 R.Datta, (1986) Acetone-Butanol Fermentation Process, Biotechnology Progress (1986) 2, 1. 23-28)。当前，两家公司，Gevo 和 Butamax 参 与使用重组微生物转化若干乙醇工厂以生产异丁醇用于新化学物质使用。参见美国专利号 8, 017, 375和美国专利号7, 851，188。在全部这些开发中，主要的原料是碳水化合物，主要 是来自玉米的淀粉。
[0005] 碳水化合物原料的限制是公知的并且一些是根本性的。来自农业作物的淀粉和糖 遇到食物vs.能源/化学生产的竞争问题以及原料的成本和其可用性。对于木质纤维素原 料诸如木质生物质，草等，来自预处理和水解过程的成本和产率是非常限制性的。例如，典 型的木质生物质含有50%纤维素而剩余由半纤维素、木质素和其他级分构成。可发酵级份 的化学能量含量通常少于原料的50%，对产物产率有根本的限制。
[0006] 已经进行尝试以提高将多种糖发酵为乙酸盐和丁酸盐的细菌的醇产率。本 领域已经寻求采用重组技术以转化细菌诸如丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum) (Green 等人(1996)Genetic manipulation of acid formation pathways, Green 等 人 Microbiology), 142, 2079-2086)和酪丁 酸梭菌（C. tyrobutyricum)(X. Liu 等人 (2006)Construction and Characterization of ack Deleted Mutant of Clostridium tyrobutyricum, Biotechnology Pref.，22, 1265-1275)。然而，此类技术仅仅导致以低频率 发生的转化。
[0007] 若干种微生物能够使用一碳化合物作为碳源并且一些甚至作为能源。合成气是提 供一碳化合物诸如C0和C02和以及氢气的常见底物。合成气可以通过整个生物质源的气 化生产而无需释放某些级份。合成气也可以从其他原料经由：（i)煤，（ii)市政废品，（iii) 塑料废品，（iv)石油焦和（V)来自精炼厂或来自纸工业的液体残余物（黑液）的气化生产。 合成气也可以从天然气经由蒸汽重整或自热重整（部分氧化）生产。
[0008] 当合成气源是生物质时，气化技术将原料的全部组分主要转化为CO、H2、C0 2和一 些残余CH4的混合物，通常具有75至80 %冷气效率，即原料的化学能源的75至80 %可用于 进一步的化学或生物学转化至靶产物。剩余的能量可作为热获得，所述热可用于生成蒸汽 以提供一些或全部所需的过程能量。此外，可以气化多种原料，可再生的诸如木质生物质、 农业残余物、市政废品等或非可再生的诸如天然气，以生产这些主要的组分。使用蒸汽、氧 气、空气或其组合可以以以多种技术将天然气经济地重整为合成气。此合成气具有约85% 的非常好的冷气效率以使用多种靶组合物生产〇)、4和C0 2。
[0009] 因此，合成气是非常经济的原料，其可衍生自可再生的和非可再生的多种原材料。 因此，以高产率和浓度将合成气转化为丁醇将导致此重要化学物质的经济生产。
[0010] 厌氧细菌从主要合成气组分CO和H2/C02生产n- 丁醇的能力在1990/1991由来 自 Michigan Biotechnology Institute 的队伍发现并报告，（A.Grethlein 等人（1991) Evidence of n-Butanol Production from Carbon Monoxide, Journal of Fermentation and Bioengineering, 72, 1，58-60) ； (Grethlien 等人(1990)Continuous Production of Mixed Alcohols and Acids from Carbon Monoxide, Journal of Fermentation and Bioengineering, 24-25(1): 875-885)。晚些，其他组织诸如 University of Oklahoma 和 Oklahoma State University 也分离 了新的生物即 Clostridium Carboxydivorans，其 也显不了此类转化和 n_ 丁醇生产 J. S. Liou 等人（2005)Clostridium carboxidivorans sp. nov. a solvent producing clostridium International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology55 (5) : 2085-2091)。在单个培养发酵中使用这些和其他生物 的随后的发酵开发尚未非常成功-达到的n-丁醇浓度在约3g/升的范围并且产率范围 为从理论的20至45% (%电子至产物）（参见先前的三份参考和Guilaume Bruant等人 (2010)Genomic Analysis of Carbon Monoxide Utilization and Butanol Production by Clostridium carboxidivorans，PLoS One, 5 (9))。对于商业成功的方法，n_ 丁醇浓度应当 在8-10g/升的范围并且产率应当在80%范围中，否则加工和分离成本将变得无吸引力。
[0011] 为了克服这些障碍已经提出了使用一种或多种生物诸如甲基营养丁酸杆 菌（Butyribacterium methylotrophicum)和丙酮 丁醇梭菌的多步发酵（Worden 等人(1991)Production of butanol and ethanol from synthesis gas via fermentation, Fuel, 70, 6154-619)。前者将以低浓度从合成气生产丁酸和丁醇而后者将摄 入这些同时转化碳水化合物以生产更多丁醇。因为丙酮丁醇梭菌菌株能够生产15g/升丁 醇，分离过程将是可行的。此类组合将提供产率和产物回收的一些增加，但需要两种不同类 型的原料，合成气和碳水化合物，以及单独的生物反应器，一个用于气体转化而另一个用于 碳水化合物转化，将是非常麻烦的。此外，在这个方案中，主要的原料是饲喂丙酮丁醇梭菌 的碳水化合物，而不是饲喂甲基营养丁酸杆菌的更为经济的合成气，并且上述碳水化合物 原料的全部限制将是普遍的。
[0012] 合成气的更有效率的转化发生在当将其转化为乙醇和乙酸盐时。此类合成气转 化的生物化学途径由Wood-Ljungdahl途径描述。将合成气发酵为乙醇和乙酸盐提供了若 干优势，诸如生物催化剂的高特异性，较低的能量成本（因为低压和低温生物转化条件）， 对生物催化剂中毒的更大的抵抗和对预先设定的4比CO比率几乎没有限制（M. Bredwell 等人（1999) Reactor design issues for synthesis-gas fermentations, Biotechnology Progress 15, 834-844) ;(Klasson 等人（1992)，Biological conversion of synthesis gas into fuels"，International Journal of Hydrogen Energy 17，第 281 页）。产乙酸 菌是能够将合成气组分，如(：0、〇)2和H2还原性乙酰-CoA或Wood-Ljungdahl途径转化为乙 酸盐和乙醇的一组厌氧细菌。
[0013] 已经分离了具有将合成气发酵为乙醇、乙酸和其他有用终产品的能力的若干种 厌氧细菌。扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)和 Clostridium autoethanoge