科学研究院细胞中心)评价了抗Her2抗体-小分子药物偶联物对肿瘤细胞 的抑制作用，具体研究过程如下：采用胰蛋白酶（〇. 25%，V/V)消化SK-BR-3和A549,使细胞 剥离，之后悬浮于100 μ L完全培养基中，取10, 000个细胞接种于96孔板进行培养，37°C过 夜贴壁生长，再加入100 μ L含有不同浓度的抗Her2抗体和抗Her2抗体-小分子药物偶联 物Ι-b的培养基。72h后，用PBS (pH7. 5)洗板两次，用CCK-8试剂盒(活细胞计数试剂盒， YEASEN)分析相对细胞增殖。
[0201] 研究结果表明：抗Her2抗体-小分子药物偶联物1-c相对抗Her2抗体能更有效 地抑制Her2阳性细胞系SK-BR-3的增殖（图2)。而无论是裸抗抗Her2抗体，还是抗Her2 抗体偶联物1-c对Her2表达阴性的A549细胞没有生长抑制作用（图3)。
[0202] 实施例10,抗Her2抗体偶联物的体内抗肿瘤特性。
[0203] 抗Her2抗体偶联物的体内抗乳腺癌特性是通过对Her2表达阳性的人 BT474肿瘤细胞在裸鼠体内的生长抑制效果来评价的，具体研究过程如下：BT474细胞 (ATCC，HTB-20?)生长于含10%的胎牛血清和添加有2mM谷氨酰胺的RPMI-1640培养基。收 集BT474细胞重悬于PBS，使100 μ L体积含有6 X IO7细胞，取9周龄的雌性裸鼠，在其右腋 注射200 μ L上述细胞悬液。当肿瘤体积达到180~240mm3时开始分组给药，每组10只。 抗Her2抗体偶联物1-c和抗Her2抗体分别按每公斤体重5、15mg抗体量的剂量，每三周一 次，共给药3次；对照抗体（KadaylaM-K，LotN0001Bll)按每公斤体重15mg抗体量的剂量， 每三周一次,共给药3次。给药方式为静脉注射，注射体积为每次100 μ L。肿瘤体积每周测 定两次，最后一次给药继续观察一周并测定肿瘤体积大小后(第一次给药49天后)，动物被 立即以过量麻醉致死。
[0204] 研究结果表明：在同等剂量下，抗Her2抗体偶联物1-c比抗Her2抗体更能够抑制 肿瘤细胞的生长；与对照抗体相比，抗Her2抗体偶联物1-c抑制肿瘤细胞生长的作用更强， 至第7天，抗Her2抗体偶联物l-cl5mg/kg剂量下已检测不到肿瘤（图4)。
[0205] 实施例11，抗Her2抗体-小分子药物偶联物急性毒性研究
[0206] 抗Her2抗体-小分子药物偶联物的急性毒性的研究主要通过考察大鼠给药后身 体状态和生化指标水平的变化评价的，具体研究过程如下：取健康的Wister雌性大鼠40只 (购自中国科学院上海实验动物中心)，鼠龄为出生后4周，体重180~220g，分为4组，每组 10只。按常规饲养一周后，开始实验。两种抗Her2抗体-小分子药物偶联物l-b，l-c和对 照抗体（Kadaylas，K，LotNOOOlBll)分别按每公斤体重60mg抗体量的剂量，以给予空白溶 剂的大鼠作为正常对照，经尾静脉缓慢注射，单次给药，每天按时记录大鼠的体重，并于第5 天取血进行血生化检测，检测项目包括：AST、ALT、TBIL和GGT，实验开展至第10天，动物被 以过量麻醉致死，期间观察大鼠是否有死亡的情况。
[0207] 大鼠急性毒性的结果表明：相比与正常对照组的大鼠，两种抗Her2抗体-小分 子药物偶联物1-b，I-C和对照抗体对大鼠肝功能有不同程度的损伤，表现为：其AST、ALT、 TBIUGGT指标相比正常对照组较高。但相比而言，两种抗Her2抗体偶联物1-b，1-c的AST、 ALT、TBIL、GGT指标低于对照抗体，表明1-b，1-c对肝功能的损伤程度低于对照抗体(表1); 此外，对照抗体给药后大鼠的死亡率为20%，而其中一种抗Her2抗体-小分子药物偶联物 Ι-b给药后大鼠死亡率为10% (图5)，1-c给药后大鼠未发生死亡与正常对照组大鼠相当， 可见两种抗Her2抗体-小分子药物偶联物相比对照抗体毒性较低。
[0208] 表1各组大鼠生存情况和肝功能变化比较
[0209]
【主权项】
1. 一种抗体-小分子药物偶联物，其特征在于具有式1-a的化合物或其药学上可接受 的盐或溶剂化合物结构， 其中，R1为-OH或者-SH， R2 为-CH3, -CH2OH 或-CH2OC (=0) R9， R3 为 H、OH、OC (=0) R9 和 OR9 基团， R4为氢、C1X6烷基、C3-C6环烷基和C (=0)R9， R5为!1或C1-C6烷基， R6为氢或氨基酸侧链， R7为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C 6环烷基，氨基酸侧链， R8为氢、氨基酸侧链或者-SO3H, X1为0, S，亚胺基， X2为0, S，亚胺基，或无取代基团， Y为符合式Ι-y-i或者式Ι-y-ii的下列结构，Rltl为亚甲基，C3-C6环烷基，苯基及其衍生物， η 为 0, 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 其中波浪线表示与相邻结构共价连接， Ab为抗HER2人源化单克隆抗体， P为小分子药物与抗体的比例，为1，2, 3, 4, 5, 6。2. 根据权利要求1中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于式Ι-a中包含式 1-a-i为美登素衍生物部分， 其中，R1为-OH或者-SH， R2 为-CH3, -CH2OH 或-CH2OC (=0) R9， R3 为 H、OH、OC (=0) R9 和 OR9 基团， R4为氢、C1X6烷基、C3-C6环烷基和C (=0)R9， R5为!1或C1-C6烷基， R6为氢或氨基酸侧链， 其中波浪线表示与相邻结构共价连接。3.根据权利要求1中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于式Ι-a中包含式 Ι-a-ii为化学连接子部分， 其中， R7为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C 6环烷基，氨基酸侧链， R8为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C 6环烷基，氨基酸侧链或者-SO3H, X1为0, S，亚胺基， X2为0, S，亚胺基，或无取代基团， Y为符合式Ι-y-i或者式Ι-y-ii的下列结构，Rltl为亚甲基，C3-C6环烷基，苯基及其衍生物， η 为 0, 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 其中波浪线表示与相邻结构共价连接。4. 一种具有化学连接子的美登素类衍生物小分子药物的化学前体，其结构为 其中，R1为-OH或者-SH， R2 为-CH3, -CH2OH 或-CH2OC (=0) R9， R3 为 H、OH、OC (=0) R9 和 OR9 基团， R4为氢、C1X6烷基、C3-C6环烷基和C (=0)R9， R5为!1或C1-C6烷基， R6为氢或氨基酸侧链， R7为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C 6环烷基，氨基酸侧链， R8为氢、氨基酸侧链或者-SO3H, X1为0, S，亚胺基， X2为0, S，亚胺基，或无取代基， Y1为符合式Ι-y-iii或者式Ι-y-iv的下列结构，Rltl为亚甲基，C3-C6环烷基，苯基及其衍生物， Rn为卤素，活性酯类化合物， η 为 0, 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 其中波浪线表示与相邻结构共价连接。5. -种化学连接子的化学前体药物，其结构为， 其中，R7为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C 6环烷基，氨基酸侧链， R8为氢、氨基酸侧链或者-SO3H, R12为卤素，活性酯类化合物， X1为0, S，亚胺基， X2为0, S，亚胺基，或无取代基， Y1为符合式Ι-y-iii或者式Ι-y-iv的下列结构， 其中，Rltl为亚甲基，C3-C6环烷基，苯基及其衍生物， Rn为卤素，活性酯类化合物， η 为 0, 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 其中波浪线表示与相邻结构共价连接。6. -种化学连接子，其结构为式1-a-ii， 其中，R7为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C 6环烷基，氨基酸侧链， R8为氢，甲基，C1-C6烷基，C3-C 6环烷基，氨基酸侧链或者-SO3H, X1为0, S，亚胺基， X2为0, S，亚胺基，或无取代基团， Y为符合式Ι-y-i或者式Ι-y-ii的下列结构，Rltl为亚甲基，C3-C6环烷基，苯基及其衍生物， η 为 0, 1，2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 其中波浪线表示与相邻结构共价连接。7. 根据权利要求1-3中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于具有式Ι-b的化 合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，其中，P为小分子药物与抗体的比例，平均值介于3-4之间，Ab为抗Her2人源化单克隆 抗体。8. 根据权利要求1-3中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于具有式1-c的化 合物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物结构，其中，P为小分子药物与抗体的比例，平均值介于3-4之间，Ab为抗Her2人源化单克隆 抗体。9. 根据权利要求7-8中所述的抗体-小分子药物偶联物，其特征在于抗Her2人源化单 克隆抗体为曲妥珠单抗。10. -种抗体-小分子药物偶联物的制备方法，具体包括如下步骤， a，制备抗体， b，将美登素衍生物化学前体与权利要求5所述的化学连接子前体进行合成，并修饰成 为适合抗体偶联的小分子药物， c，将步骤a获得的抗体与步骤b获得的小分子药物进行偶联反应，合成抗体-小分子 药物偶联物。11. 一种抗体-小分子药物偶联物用于制备抑制肿瘤生长药物的用途，其特征在于肿 瘤过度表达Her2受体。12. 根据权利要求11所述的用途，其特征在于肿瘤是癌症，所述癌症选自乳腺癌，胃 癌，卵巢癌，结直肠癌或者胰腺癌。
【专利摘要】一种抑制肿瘤生长的抗体-小分子药物偶联物及其制备方法和用途，本发明提供了一种抗Her2抗体-小分子药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate或ADC），对传统的单克隆抗体进行偶联物修饰，选择较传统化学连接子（Linker）在体循环前更为稳定的不可切除化学连接子（Linker）。该偶联物较传统的化学治疗、放射性治疗具有更强的靶向性。较之传统的抗Her2单克隆抗体，提高了药效治愈窗口。并且在体循环中具有更好的稳定性，降低了药物进入肿瘤细胞前的毒性。本发明提供了该抗体-小分子药物偶联物的制备方法和用途。
【IPC分类】A61P35/00, C07D519/00, A61K31/5386, A61K47/48, C07D491/056, C07K16/28, C07D495/04
【公开号】CN104974252
【申请号】CN201410129976
【发明人】龙桂霞, 周伟, 史俊, 张笋华
【申请人】上海中信国健药业股份有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月1日