克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0045] 实施例1、茄子SmGGP基闵的克降
[0046] 1.植物材料的获得
[0047] 本实验所用的植物材料为茄子优良种质资源蓝山禾线茄。实验材料栽培于上海市 闵行区浦江镇航天育种基地的人工塑料大棚中。在自然条件下育苗，生长并结实。采集茄 子的叶片用于提取RNA。
[0048] 2. RNA 的提取
[0049] 采用TRIzoI法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程（上海）股份有限公司）。 用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计（Thermo Scientific NAN0DR0P 1000 Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。
[0050] 3.基因的全长克隆
[0051] 基于Genbank中GGP基因的保守序列设-H对简并引物。将提取RNA进行反转录 (Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit :宝生物工程（大连）有限公司），以 第一链cDNA为模板，利用引物
[0052] F1(SEQ ID NO. 4) :5' -ATGATGCTYARRATYAAGAGGGTTCC-3，
[0053] R1(SEQ ID NO. 5) :5，-TAKKCGGGAACCATGGTASYRTGG-3，
[0054] 进行PCR，扩增得到预期长度后回收并连接到pMD-19T (宝生物工程（大连）有限 公司）载体上，转化大肠杆菌DH5a，利用α互补及菌落PCR筛选阳性克隆，送至英潍捷基 (上海）贸易有限公司进行测序，得cDNA序列SEQ ID NO. 1。
[0055] 实施例2、茄子GGP基闵的序列信息与同源件分析
[0056] 本发明新的茄子GGP基因全长⑶S开放读框序列为1314bp，详细序列见SEQ ID NO. 1。根据CDS开放读码框序列推导出前子GGP的氨基酸序列，共437个氨基酸残基，分子 量为48710. 4道尔顿，理论等电点（pi)为4. 71，详细序列见SEQ ID NO. 2所示序列。
[0057] 将茄子GGP的CDS开放读框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+P DB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与番 茄GGP基因（JQ517313. 1)在核苷酸水平上具有93. 76%-致性，如图1所示（Query :茄子 GGP的mRNA序列；Sb jet :番茄GGP的mRNA序列）；在氨基酸水平上，它们两者之间相似性高 达95. 19%，如图2所示（Query :茄子GGP的氨基酸序列；Sb jet :番茄GGP的氨基酸序列）。 由此可见，茄子GGP基因与番茄GGP基因无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。
[0058] 实施例3、茄子GGP基闵的启动子克降与序列分析
[0059] 采用Genome Walking Kit试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司），设计引物
[0060] SPI ： 5r -TTGAAACAATACAGCGGTAGCTTTGA-3r
[0061] SP2 ： 5r -GAAGGCAGCAGTTCCTGAGGCAATT-3r
[0062] SP3 ： 5r -CACCACGAGCACCAATTTCATCCACC-3r
[0063] 以DNA为模板，进行三轮PCR扩增，扩增得到产物后回收并连接到pMD-19T (宝生 物工程（大连）有限公司）载体上，转化大肠杆菌DH5a，利用α互补及菌落PCR筛选阳性 克隆，送至英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。测序结果发现得到茄子GGP基因启 动子536bp。序列提交到PLACE和PlantCARE两个顺式元件在线预测软件进行分析，发现其 含有很多光响应元件，包括G-box、GA-motif、GATA-motif、GTl-motif等；它还含有脱落酸 响应元件ABRE。详细序列见SEQ ID NO. 3所示序列。
[0064] 实施例4、茄子GGP基闵在不同组织中的表汰差异和在低淵下的表汰樽式
[0065] 1.植物材料的获得
[0066] 在果实成熟期分别采集茄子根、茎、叶、花、果皮、果肉，将样品分别用铝铂纸包好 后立刻投入液氮中，接着转入-80°C超低温冰箱中贮存待用。
[0067] 将位于人工气候培养箱中同期播种且长势一致的茄子幼苗置于4°C，分别在Oh、 lh、3h、6h、12h、24h和48h取处理材料的叶片，用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转 入-80°C超低温冰箱中贮存待用。
[0068] 2. RNA 的提取
[0069] 采用TRIzoI法提取总RNA(TRIzol购自生工生物工程（上海）股份有限公司）。 用普通琼脂糖凝胶电泳（胶浓度1. 2% ;0. 5XTBE电泳缓冲液；150v，15min)检测完整性。 电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1. 5-2. 0倍，否则表示rRNA样品的降解。 纯度较好的RNA，A26tlA28tl以及A 26(i/A23(i约为2. 0左右。用分光光度计测定OD值并计算RNA 含量。
[0070] 3. cDNA 的获得
[0071] 以 500ng 的总 RNA 为模板，按照宝生物公司 TaKaRa PrimeScript? RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒操作说明进行反转录获得cDNA备用。
[0072] 4.设计特异性引物以进行实时荧光定量PCR分析基因在不同组织中和低温下的 表达量。根据已经获得的茄子GGP基因序列，利用引物设计软件设计用于Real-time PCR 中SmGGP基因定量分析的特异性引物，
[0073] GGP-F :5' -GCAAGTTCAACTTCACTAAGGTTGG-3'
[0074] GGP-R : 5，-GGCACTCAAGGACCTTAGGGATCA-3，
[0075] 内参基因为Actin (⑶984779. 1)，其引物为
[0076] ACTIN-F :5，-GTCGGAATGGGACAGAAGGATG-3，
[0077] ACTIN-R :5 ' -GTGCCTCAGTCAGGAGAACAGGGT-3 '
[0078] 5.制作目的基因及内参基因的标准曲线。用EASY Dilution(试剂盒提供）将标 准品cDNA溶液进行梯度稀释，然后分别以稀释后的cDNA溶液为模板，以目的基因及内参基 因的特异性引物进行Real-time PCR扩增，反应结束后绘制溶解曲线和标准曲线。分析溶 解曲线，判断目的基因及内参基因的溶解曲线是否得到单一峰，以判断使用该引物能否得 到单一的PCR扩增产物。通过标准曲线确定模板cDNA的合适稀释倍数。
[0079] 6.待测样品中目的基因的实时荧光定量分析。以合成的cDNA第一条链为模板， 分别用目的基因与内参基因的特异性引物扩增进行荧光定量分析，Real-time PCR反应在 FTC-3000实时定量仪上进行，反应体系为20 μ L。反应采用三步法，95°C变性lmin，接着40 个循环：95°C 30s ;58°C 30s ;72°C 45s。每次扩增完成后，均做溶解曲线，以检验扩增产物是 否为特异产生。
[0080] 7.采用AAa法作相对定量分析。结果表明SmGGP基因在茄子的根、茎、叶、花果 皮、果肉中都有表达，其中在叶中的表达量最高，其次是花，而在根中的表达量最低，说明 SmGGP基因的表达具有明显的空间差异性（图3)。在低温胁迫下，SmGGP基因的表达量随 着胁迫时间的延长不断上升，在48h达到最大值，为未处理的4. 57倍，表明其受到低温的诱 导而表达（图4)。
[0081] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质，其特征在于，包括： (a) 由如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或 (b) 在（a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄子 GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的由（a)衍生的蛋白质。2. 根据权利要求1所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质，其特征在于， 所述蛋白质包括SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列经过1~50个氨基酸的缺失、插入和/或取 代，或者在C末端和/或N末端添加1~20个以内氨基酸而得到的氨基酸序列。3. 根据权利要求1或2所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质，其特征在 于，所述蛋白质为SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列中1~10个氨基酸被性质相似或相近的氨 基酸所替换而形成的序列。4. 一种编码权利要求1所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质的基因的 核酸序列，其特征在于，所述基因的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。5. 根据权利要求4所述的编码所述具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质的基 因的核酸序列，其特征在于，包括SEQ ID NO. 1第1~1314位所示的核酸序列中1~90个 核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60个以内核苷酸形成的碱基 序列。6. -对用于扩增权利要求4或5所述基因的核酸序列的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO. 4 和 SEQ ID NO. 5 所示。7. -种权利要求4所述的具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的蛋白质的基因的核酸 序列的启动子，其特征在于，所述启动子包括SEQ ID NO. 3所示的碱基序列。
【专利摘要】本发明公开一种茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶SmGGP蛋白及其编码基因，所述蛋白包括：(a)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有茄子GDP-L-半乳糖磷酸酶活性的由(a)衍生的蛋白质；所述编码基因具有SEQ ID NO.1所示碱基序列；该基因在根、茎、叶、花、果皮、果肉均有表达，叶中的表达量显著高于其他组织。低温胁迫下，其表达量在48h达到最大值，为未处理的4.57倍。本发明为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得高抗氧化性的药物或食物提供理论依据，具有很大的应用价值。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/54, C12N15/113, C12N9/12
【公开号】CN104974992
【申请号】CN201510333429
【发明人】陈火英, 蒋明敏, 刘杨, 任丽, 葛海燕
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月16日