500 μ L DNA wash buffer (确保加入乙醇），室温12000rpm离心 lmin，倒掉收集管中的废液。
[0215] 9)重复上一步操作。
[0216] 10)将离心柱放回离心机中，室温12000rpm开盖离心5min，除去残余的乙醇。
[0217] 11)将离心柱转至新的1.5mL离心管中，向吸附膜的中央悬空滴加70yL ElutionBuffer,室温放置5min，12000rpm离心lmin，将洗脱液重新滴加到吸附膜中央， 12000rpm离心lmin，收集含有质粒的洗脱液。
[0218] 12)质粒提取后，用NAN0DR0P2000检测产物的浓度及纯度。
[0219] (5)重组质粒的双酶切鉴定
[0220] 对上一步提取的质粒DNA用构建克隆所用的两个限制性内切酶进行双酶切鉴定， 依据测定的质粒浓度，按照表9配制酶切体系，37°C酶切lh。剩余的质粒保存备用。
[0221] 表9双酶切鉴定的反应体系
[0222]
[0223] 用0. 8%的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，DNA Marker使用DL2000和λ -Hind III (使用前60°C加热5min)。
[0224] (6)重组质粒的测序
[0225] 根据琼脂糖凝胶电泳结果，选择双酶切阳性的质粒，送检至华大基因公司测序。
[0226] I. 2. 1PNGF2 的原核表达
[0227] I. 2. I. 1重组质粒转化
[0228] 本试验选择的表达宿主菌为E. coli BL21 (DE3)，该菌以T7RNA聚合酶介导的高效 表达外源基因的蛋白表达宿主。经测序验证正确的PNGF2重组质粒转化至BL21(DE3)感受 态细胞，步骤如下：
[0229] 1)从_80°C冰箱中取50 μ 1感受态细胞，于冰浴上融化，再加入1 μ 1重组质粒，轻 弹混匀，冰浴放置30min。
[0230] 2)42°C水浴热激90s，然后快速将管转移到冰中放置2min，该过程注意不要摇动 管。
[0231] 3)向管中加300 μ 1灭菌LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37°C下200rpm振 荡培养lh，使细菌复苏。
[0232] 4)用移液器将200ul菌液涂布到含50 μ g/ml卡那霉素抗生素的LB琼脂培养基 上，倒置平板，37°C过夜培养（约12h)。
[0233] L 2. I. 2PNGF2 蛋白表达
[0234] 先在没有诱导物的条件下，细菌进入最佳生长状态时，向培养基中加入诱导物 IPTG，与阻遏蛋白结合解除抑制，使外源基因大量表达。
[0235] 诱导步骤如下：
[0236] 1)选取含PNGF2重组质粒的BL21和空载体为对照，挑单菌落，并分别接种至5ml LB培养基（含10-200 μ g/ml卡那霉素）中，37°C，200rpm振荡培养10-12h，取样IOOul至 I. 5ml离心管，-20°C保存，用于SDS-PAGE。
[0237] 2)分别向菌液中加入IPTG (终浓度在0. 1-lOmM)，20-37°C，200rpm振荡培养12h， 诱导目的基因 PNGF2表达。
[0238] 3)诱导前和诱导后的菌液分别取100 μ L，12000rpm离心lmin，弃上清。
[0239] 4)向沉淀中加100 μ LI XPBS重悬菌体，吹吸混匀。每管中再取出30 μ L于新的离 心管中，分别加入7. 5 μ L5 X SDS上样缓冲液，95°C煮IOmin。
[0240] 5)使用 Unstained Protein MW Marker 用作对照，使用前 95°C煮 lOmin。
[0241] 6)再将样品于 12000rpm 离心 lOmin。
[0242] 7)取15 μ L上清样品点样，先用15mA进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑至分离胶时，将 电流调成30mA电泳使溴酚蓝跑到凝胶边缘。
[0243] 8)考马斯亮蓝染色lh，脱色液脱色2h，脱色两次。拍照保存结果。
[0244] L 2. 2重组蛋白PNGF2的纯化
[0245] 重组蛋白PNGF2的纯化经过三个步骤，第一步为镍柱亲和层析，第二步为分子筛 层析，第三步超滤。纯化的所有操作均在4°C下进行。
[0246] A.镍柱纯化
[0247] 1)含重组质粒的单克隆挑至5ml的LB液体培养基（含50 μ g/mL抗生素）中， 10~14h后吸取2ml转入两个装有200ml LB培养基（含50 μ g/mL卡那霉素）三角瓶中， 37°C，200rpm振荡培养10h，共培养IL菌液。
[0248] 2)将2. 3. 2中诱导的两瓶菌液分别加入两个大离心管中，用IXPBS配平后，4°C， 5000rpm离心10min，尽量吸去上清。
[0249] 3)向上一步的沉淀中加入200mLlXPBS洗涤细菌细胞，4°C，5000rpm离心10min。
[0250] 4)去上清，两管中分别加入7. 5mL Lysis Buffer (IOmM咪唑，ρΗ8· 0)重悬菌体，然 后再加入溶菌酶（终浓度为lmg/mL)，充分混匀后，在冰上孵育30min，期间摇晃2~3次。
[0251] 5)在冰浴条件下，35%功率超声破碎菌体30min，工作3s停顿7s，避免温度过高。
[0252] 6)将细菌裂解物液于4°C，12000rpm离心30min，小心轻轻取上清，避免吸起沉淀， 缓慢沿壁转入新的离心管中。
[0253] 7)使用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白，先加3倍柱体积的0. 5MNaOH洗柱（柱 再生）；再用3~5倍柱体积的Lysis Buffer洗柱（平衡柱）；平衡后将上一步的上清液加 入柱中，待液体快流完时，分别用Wash Buffer (25mM咪唑，ρΗ8· 0)和Elution Buffer (300mM 咪唑，pH8. 0)淋洗，依次收集不同的洗脱液，收集到的目的蛋白保存在4°C。
[0254] 8)将所有收集到的样品进行SDS-PAGE鉴定，均取10 μ 1点样。
[0255] 9)使用30kD的超滤管对目的蛋白进行超滤纯化。
[0256] 10)利用BCA法检测目的蛋白的浓度，根据已知浓度的各种蛋白标准品，使用 TECAN酶标仪，通过制作标准曲线来检测目的蛋白的浓度。
[0257] B.分子筛层析
[0258] 分子筛柱选用GE公司Superdex20016/60，上分子筛所用的缓冲液为 (lOmMTris-HCl，IOOmM NaCl，pH8. 0)，具体操作方法见操作手册。
[0259] C.超滤
[0260] 经过分子筛过柱得到PNGF2蛋白，一部分蛋白用孔径为30KD的超滤管 (Millipore，美国）的方法，将蛋白浓缩至60mg/ml，用于后续的蛋白结晶实验；另一部分蛋 白则用30KD的超滤管去除盐离子，用PBS洗涤3次，最后PBS buffer (pH7. 4)溶解蛋白，分 装后，一 20°C保存备用，用于后续的PNGF2功能分析。
[0261] 2 结果
[0262] 2. lPNGF2/pET28a 重组质粒构建
[0263] 将目的基因 PNGF2片段克隆至pET28a载体上，结果如图11所示。
[0264] 2. 2IPTG 诱导表达
[0265] 重组的阳性克隆经测序鉴定正确后，转化至E. coli BL21，随机挑选两个单克隆分 别接种至LB培养基中，加入IPTG诱导表达，分别在诱导后6h和12h取样，结果如图12所 示，结果表明加入IPTG诱导12h左右，PNGF2有较高的表达量。
[0266] 2. 3重组蛋白PNGF2的纯化
[0267] 重组蛋白PNGF2经过镍柱亲和层析纯化后，可得到较纯的蛋白，见图13,但是不能 满足蛋白结晶的条件，继续用分子筛层析纯化（图14)，并对纯化的蛋白检测其280nm吸收 峰（图15)在主峰位置收集蛋白目标蛋白，经过纯化得到了纯的均一的PNGF2蛋白。
【主权项】
1. 一种N-糖苷酶，其特征在于，所述的N-糖苷酶的氨基酸序列为下列两种任选一个： a) 具有如SEQ ID NOl所示的序列； 或者 b) 与SEQ ID NOl所示的序列具有70%以上的同源性并且具有N-糖苷酶的活性。2. -种编码N-糖苷酶的核酸，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的N-糖苷 酶。3. -种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的核酸。4. 一种N-糖苷酶，其特征在于，所述的N-糖苷酶能够切除糖蛋白底物上的N-连接糖 链。5. 权利要求1所述的N-糖苷酶在用于切除糖蛋白底物上的N-连接糖链中的应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白底物是HRP糖蛋白。7. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白底物是高甘露糖型糖链N-糖 蛋白。8. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的N-连接糖链的接点是带有由a-1-3 糖苷键连接的岩藻糖。9. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的糖蛋白底物是杂合型糖链N-糖蛋白。10. 权利要求1所述的N-糖苷酶的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 1) 获得并扩增权利要求1所述的N-糖苷酶的基因序列； 2) 构建含有权利要求1所述的N-糖苷酶的基因序列的重组载体； 3) 表达权利要求1所述的N-糖苷酶； 4) 分离纯化并鉴定。11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的表达的系统是细菌、酵母或者昆虫 表达系统。12. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的方法包括常规的微生物发酵生产， 利用生物工程技术在细菌、酵母、昆虫表达系统中的表达和生产。
【专利摘要】本发明属于糖生物学研究领域，具体涉及一种新型N-糖苷酶，该新型N-糖苷酶命名为二型PNGase F，PNGaseF-II。本发明的N-糖苷酶能够将不同糖链结构类型（高甘露糖型糖链、复合型糖链、杂合型糖链）的N-糖蛋白上的糖链完整切除，并且它能够切除α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白的糖链，而已有的N-糖苷酶F（PNGase F）对α-1,3-核心岩藻糖化的N-糖蛋白没有酶切活性。本发明的酶对N-糖蛋白有较为广泛的底物和有较高的实际应用价值。本发明的新型N-糖苷酶还可以用于N-糖链结构分析、糖链的功能分析，为糖生物学以及生物医药的研究提供一种新的工具酶。
【IPC分类】C12P21/02, C12N9/24, C12N9/22, C12N15/56, C12N9/08, C12N15/70
【公开号】CN104974994
【申请号】CN201410134277
【发明人】陈力, 孙桂芹, 策力木格
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月2日