一种基于聚电解质层层自组装技术制备亚油酸异构酶微胶囊的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明所属酶工程研究开发技术领域。本发明涉及一种聚电解质层层自组装技术 制备亚油酸异构酶微胶囊的方法研究。
【背景技术】：
[0002] 亚油酸异构酶（Linoleic acid isomerase，LAI)是能将亚油酸专一转化为共轭 亚油酸的一种异构酶。随着具有强大生理功能的共轭亚油酸得到人们的广泛关注，作为生 物转化亚油酸为共轭亚油酸过程中的关键酶--亚油酸异构酶也就成为了研究的热点。目 前，游离的亚油酸异构酶在工业应用过程中存在易失活、易结块、对环境变化的耐受性不 高、难与产品分离、不能重复利用等问题，降低了酶的催化效率，同时也增加了工业生产成 本。如果能实现亚油酸异构酶固定化，不仅能够提高酶的稳定性及催化效率，更重要的是在 轻松实现酶与产品的分离的同时，还能够延长酶的使用周期，极大的降低了工业生产成本。
[0003] 传统的酶固定化技术方法主要有：吸附法、包埋法、交联法和结合法。采用传统方 法对酶进行固定化可以提高酶的催化效率、稳定性及半衰期等，这些方法都各具优缺点，需 根据实际需要进行选择。利用聚电解质层层自组装技术可以制备中空微胶囊，用以进行酶 的固定化，因其具有高的比表面积、载酶量和胶囊壁厚可控等优点，在酶固定化领域具有巨 大应用潜力。
【发明内容】
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[0004] 发明目的在于提供一种聚电解质层层自组装技术亚油酸异构酶微胶囊的制备方 法，采用本发明制备出的亚油酸异构酶微胶囊具有活性高、稳定性好、半衰期长等优点。
[0005] 本发明所涉及的技术方案：本发明利用聚电解质层层自组装技术，以碳酸钙和亚 油酸异构酶共沉淀得到的无定型碳酸钙晶体为模板，以聚烯丙胺盐酸盐和聚苯乙烯磺酸钠 为包覆材料，制备出具有高活性、较好稳定性、半衰期长的亚油酸异构酶微胶囊。具体步骤 如下：
[0006] 模板的制备：将0· 33mol / L含碳酸根无机盐、0· 33mol / L含钙离子无机盐和 0. 34mg/mL亚油酸异构酶按照体积比为I : I : 1或I : 1 : 2的比例均匀混合，混合后 离心收集无定型碳酸钙晶体，即为模板，将模板用去离子水洗涤两次；
[0007] 亚油酸异构酶微胶囊的制备：
[0008] (1)将步骤1所得模板移入lmL5mg / mL的带有正电性的聚电解质溶液中，悬浮吸 附lOmin，离心弃去上清，用去离子水洗涤3次，使带有正电性的聚电解质被吸附在模板表 面，即得第一层包覆有带正电性聚电解质的微粒；
[0009] (2)向步骤2(1)所得的微粒中加入lmL5mg / mL的带有负电性的聚电解质溶液， 悬浮反应5min，离心弃去上清，用去离子水洗涤3次，即得包覆两层聚电解质的微粒；
[0010] (3)向步骤2(2)所得的微粒中加入lmL5mg / mL的带有正电性的聚电解质溶液， 悬浮反应5min，离心弃去上清，用去离子水洗涤3次，即得包覆三层聚电解质的微粒；
[0011] (4)重复步骤2(2)和（3)，直至八层，即得含有碳酸钙的亚油酸异构酶微胶囊，此 时微胶囊粒径为549nm ;
[0012] (5)通过分解方法将步骤2 (4)所述的微胶囊中的碳酸钙去除，离心洗涤即得中 空微胶囊，微胶囊中含有预先包埋的亚油酸异构酶，此时微囊化亚油酸异构酶的比活力为 2080. 3593U / mg，固定率为94.8416%，最适反应温度为501：，最适反应？!1为5，半衰期为 29. 5833 天。
[0013] 所述步骤中含碳酸根无机盐为碳酸钠，含钙离子无机盐为氯化钙。
[0014] 所述步骤中带正电性聚电解质为聚烯丙胺盐酸盐，带负电性聚电解质为聚苯乙烯 磺酸钠。
[0015] 所述步骤中分解碳酸钙方法为乙二胺四乙酸分解。
[0016] 所述步骤中乙二胺四乙酸分解碳酸钙的同时也螯合掉了亚油酸异构酶活性中心 的镁离子，为了恢复亚油酸异构酶的活性，需要添加含镁离子无机盐。
[0017] 上述中含镁离子的无机盐为氯化镁。
[0018] 有益效果：
[0019] 1.与传统固定化酶方法相比，采用本发明制备的亚油酸异构酶微胶囊壁厚可控， 比表面积与载酶量较高。
[0020] 2.可以通过控制模板的尺寸来控制亚油酸异构酶微胶囊的尺寸。
【附图说明】：
[0021] 图1反应温度对微囊化亚油酸异构酶和游离亚油酸异构酶的影响。为温度对采用 本发明方法制备出的亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶酶活力的影响。
[0022] 图2微囊化亚油酸异构酶和游离亚油酸异构酶的热稳定性的比较。为采用本发明 方法制备出的亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶热稳定性的比较。
[0023] 图3反应pH对微囊化亚油酸异构酶和游离亚油酸异构酶酶活力的影响。为pH对 采用本发明方法制备出的亚油酸异构酶微胶囊与游离亚油酸异构酶活力的影响。
[0024] 图4微囊化亚油酸异构酶和游离亚油酸异构酶酸碱稳定性的比较。为采用本发明 方法制备出的亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶酸碱稳定性的比较。
[0025] 图5微囊化亚油酸异构酶和游离亚油酸异构酶半衰期的比较。为采用本发明方法 制备出的亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶半衰期的比较。
【具体实施方式】：
[0026] 本发明所述的设计聚电解质层层自组装制备亚油酸异构酶微胶囊的方法包括以 下实例，下述实例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0027] 实例1 :温度对酶促反应的影响
[0028] 将亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶分别在20、30、40、50、60、70、80°〇的 温度条件下反应，测定其酶比活力；以最高酶比活力为1〇〇%，其它温度下的酶比活力与最 高酶比活力的比值为相对比活力，各温度条件下亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶 的相对比活力如表1及图1所示。
[0029] 表1温度对酶促反应的影响
[0030] Tab. IEffect of temperature on the enzymatic reaction
[0031]
[0032] 从表1及图I中可以看出，游离亚油酸异构酶的最适反应温度是40°C，亚油酸异构 酶微胶囊的最适反应温度是50°C，亚油酸异构酶微胶囊最适反应温度高于游离酶，在较高 温度条件下经微囊化亚油酸异构酶的相对比活力要高于游离酶。
[0033] 实例2 :亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶热稳定性的比较
[0034] 将亚油酸异构酶微胶囊和游离亚油酸异构酶分别在20、30、40、50、60、70、80°C的 温度条件下保温一小时，保温结束后在37°C条件下进行酶促反应，测定其酶比活力；以最 高酶比活力为100%，其它温度下的酶比活力与最高酶比活力的比值