一种加速聚合酶螺旋反应的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种加速聚合酶螺旋反应的方法及其 应用。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，即PCR技术，是美国Cetus公司 人类遗传研宄室的科学家K. B. Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或 DNA序列的方法，特点是利用耐热的DNA聚合酶，将引物和目标DNA混合，经过高温变性、低 温退火和适温延伸3个过程为一个周期进行循环，将目标DNA在短时间内得到大量扩增。 PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出的优点；能在一个 试管内将所要研宄的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼 能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研宄 和检测鉴定。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑，但PCR技术一直无法 摆脱热循环的限制，经过几十年技术的发展，一些恒温核酸扩增技术逐渐被发明出来。
[0003] 核酸恒温扩增技术是指在温度不变的情况下将目标基因大量复制的技术，核酸恒 温扩增方法目前主要包括以下几种：
[0004] TAS，即转录依赖的扩增系统（Transcript-based Amplification System)，是美 国SISKA诊断研宄所和Salk研宄所于1989年共同研发的，主要应用于RNA的扩增，它的反 应原理是在逆转录酶和T7RNA多聚酶的作用下将目标RNA通过阶梯式温度变化而大量扩增 出来，在扩增过程中也主要依靠了逆转录酶的多聚酶活性和RNase H的活性，这种扩增方式 摆脱了高热循环的限制，只需要将温度进行阶梯设置，具有重大的进步意义，且具有很高的 特异性和敏感性，但在反应的过程中需要不断的添加逆转录酶和T7RNA多聚酶，使用时带 来很多不方便，而且目前只能扩增RNA。
[0005] NASBA，即依赖于核酸序列的扩增（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)，在1991年，由加拿大Can-gene公司最先发表论文介绍，NASBA是一种等 温扩增技术，它能在体外将核酸序列进行大量复制，是由两个引物介导的、稳定持续的酶促 反应。NASBA反应要依赖AMV逆转录酶、RNase H、T7 RNA聚合酶，整个反应在恒温（41 °C ) 条件下进行的，I. 5-2h即可得到理想的结果。NASBA的缺点为：在产物检测上仍需要复杂的 后续程序；酶非耐热性，且要在RNA链溶解之后才能加入；低温容易导致引物的非特异性相 互作用从而造成非特异性扩增；反应需要加入三种酶，且需要三种酶在同一温度、同一反应 体系下被激活。
[0006] 3SR，即自主序列复制（Self-Sustained Sequence Replication)，也是由美国 SISKA诊断研宄所和Salk研宄所在TAS基础上研发而来，原理同TAS基本相似，只不过多了 RNase H酶，同时其反应也必需AMV逆转录酶和T7RNA多聚酶。相比NASBA，3SR比较复杂， 敏感性不强。NASBA正逐渐取代3SR。
[0007] SDA，即链替代扩增（Strand Displacement Amplification)，是 1992 年由美国学 者Wallker等人建立，它利用限制性内切核酸酶剪切DNA识别位点的能力和DNA聚合酶在 缺口处向3'延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下将目标序列大量扩增出来。SDA的 缺点是仍需要变性的过程，扩增的靶序列不能超过200bp，后续检测复杂。
[0008] RCA，即滚环扩增（Rolling Circle Amplification)，于 1998 年被发明出来。该方 法灵感主要来自自然界微生物环状DNA的复制过程，通过体外模拟这种环状DNA的扩增而 发明的，主要通过巧妙的引物设计和在DNA聚合酶的作用下将靶序列大量扩增出来，但其 扩增产物非常复杂，且片段大小不一。由于RCA只能扩增环状的DNA模板，所以大大限制了 其的应用范围。
[0009] HDA，即依赖解旋酶基因扩增（Helicase-Dependent Amplification)，是由美国 New England Biolabs公司的科研人员Vincent等在2004年首次介绍的一种恒温体外核酸 扩增技术，它的反应原理是在解旋酶的作用下将双链DNA打开，再依靠单链DNA结合蛋白与 模板单链结合，这样就可以使DNA保持单链的状态，然后引物与单链结合，在DNA聚合酶的 作用下向前延伸。但是，HDA扩增也需要三种酶，因而大大限制了其的应用范围。
[0010] SPIA，即单引物等温扩增技术（Single Primer Isothermal Amplification)， 2005年被发明出来。该技术主要通过一条3'端是DNA片段、5'端是RNA片段的混合物， 在RNase H及具有强链置换活性的DNA聚合酶作用下，单链的cDNA便被大量的扩增出来。 SPIA扩增的温度在60°C左右，在半个小时内完成。SPIA扩增技术具有扩增效率高、保守性 强、原理简单等优点，适用于核酸检测、核酸测序、SNP检测、单链模板制备以及基因芯片探 针制备等方面。
[0011] 2000年，Notomi等人建立的一种新的体外核酸扩增技术，即环介导恒温扩增技术 (Loop-mediated Isothermal Amplification，简称LAMP)，这种新颖的扩增方法需要至少 4条引物，最多6条引物来特异性识别目标片段的6个、7个或者8个区域，在DNA聚合酶 的链置换作用下可以在很短的时间内将靶序列扩增出来，具有简单、特异、高效、迅速的特 点，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物的产生，即白色的焦磷酸镁沉淀，这一特性可以 使LAMP反应通过浊度变化来直接判断阴、阳性结果。PCR需要两条引物来特异性结合靶序 列的两个区间，而LAMP则是特异性的结合6至8个区间，所以相较于PCR，具有很强的特异 性；敏感性比普通PCR可以提高10-100倍，与荧光定量PCR的敏感性相当，而且LAMP扩增 的过程是在恒温条件下进行的，有热稳定的设备（比如恒温水浴锅、恒温金属浴等）就能满 足反应要求，因次大大降低了检测成本。自从LAMP技术被报道后，在短短的十几年的时间 里，已经被广泛应用于细菌、真菌、病毒等微生物的检测，遗传病的诊断，以及性别的早期判 定等领域。
[0012] 各种恒温扩增技术的比较结果详见表1。
[0013] 表1恒温扩增技术的比较结果
[0014]
[0015] *注：PubMed表示以各种恒温扩增技术的英文全称在PubMed所能检索到的文章 数，截止到2014年3月25日。
[0016] 这些恒温核酸扩增方法中最有优势的是LAMP法，但LAMP产物过于复杂，且LAMP 产物的回收测序很困难，不能像普通PCR产物一样直接测序；由于LAMP产物是极其复杂的 不规则的扩增混合物，因此LAMP产物不可以用来克隆。这些缺点使LAMP的应用只局限在 基因的快速检测方面。
【发明内容】
[0017] 本发明的一个目的是提供用于扩增靶序列的聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的引 物。
[0018] 本发明提供的用于扩增靶序列的聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的引物，包括特异 引物对和P对加速引物对A ;
[0019] 所述特异引物对由引物FP和引物BP组成，将所述特异引物的靶序列命名为靶序 列甲；
[0020] 所述引物FP从5'端至3'端依次由N区域和F区域组成，所述F区域与所述靶序 列甲3'末端起15-30bp核苷酸相同或互补；
[0021] 所述引物BP从5'端至3'端依次由Ν'区域和B区域组成，所述B区域与所述靶 序列甲5'末端起15-30bp核苷酸互补或相同；
[0022] 所述Ν'区域为N区域的反向不互补序列。N不与F区域相同或互补；N'不与B区 域相同或互补。
[0023] 每个所述加速引物对A的靶序列为所述靶序列甲中的某个区段，将其命名