一种鹦鹉热嗜衣原体重组蛋白GST-CPSIT_p7的制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种鹦鹉热嗜衣原体重组蛋白 GST-CPSIT_p7的制备方法及用途。
【背景技术】
[0002] 衣原体科（Chlamydiaceae)是一类专性细胞内寄生的革兰阴性细菌，可引起人类 和动物多种疾病。随着对衣原体的深入研宄，1999年根据16S rRNA和23S rRNA将其划分 为衣原体属（Chlamydia)和嗜衣原体属（Chlamydophila)。衣原体属可分为沙眼衣原体 (C. trachomatis)、鼠衣原体（C.muridarum)、猪衣原体（C. suis) 3个种；嗜衣原体属可分为 婴鸟鹉热嗜衣原体（C. psittaci)、流产嗜衣原体（C. abortus)、豚鼠嗜衣原体（C. caviae)、猫 嗜衣原体（C. felis)、兽类嗜衣原体（C. pecorum)、肺炎嗜衣原体（C. pneumoniae)6个种。 对人类影响较大的有引起沙眼衣原体（Ct)、肺炎嗜衣原体（Cpn)和鹦鹉热嗜衣原体（Cps)。 Cps可引起禽鸟类的呼吸道疾病如鹤鹉热（Psittacosis)，偶然可通过密切接触传播给人 类，发病严重，病死率高。其他哺乳动物如牛、羊、马等也分离出Cps。Cps发生感染时，根据 感染部位的不同，引起不同的症状，如心包炎、气囊炎、肺炎、腹膜炎、肝炎和脾炎，表现为发 热、厌食、倦怠、腹泻，偶尔可引起多器官功能衰竭和死亡。由于胞内寄生，疾病可呈隐匿持 续性发展，如结膜炎、眼睑炎和鼻炎。
[0003] 婴鸟鹉热嗜衣原体（Chlamydophila psittaci，Cps)是一种严格细胞内寄生、多宿 主性的人兽共患病病原体，能引起人、哺乳动物、鸟类呼吸道感染等多种疾病。Cps在宿主 细胞内生长繁殖，有独特的发育周期，该周期包括两个不同的发育阶段：一种是细胞外的 具感染性但代谢不活跃的小而致密的颗粒结构，称为原体（Elementary bodys，EBs);另一 种是细胞内的不具感染性但代谢活跃且有分裂能力的大而疏松的颗粒结构，称为网状体 (Reticulate bodys，RBs)。由于Cps的细胞内寄生性常引起隐性、持续性的感染，使得感染 反复迀延，造成进行性、不可逆的病理损伤。到目前为主，Cps的致病机制尚不清楚。衣原 体产生的效应蛋白与宿主细胞的相互作用是衣原体致病过程中必不可少的。由此可见能否 发明一种制备鹦鹉热嗜衣原体抗原重组蛋白的方法，并使制得的重组蛋白具有较好的免疫 原性，可用于探索Cps的致病机制的技术领域，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种鹦鹉热嗜衣原体重组蛋白GST_CPSIT_p7 的制备方法，该方法成功克隆表达了重组蛋白GST-CPSIT_p7,该蛋白具有较好的免疫原性， 用于探索Cps的致病机制的技术领域。
[0005] 为了达到上述技术效果，本发明的技术方案包括：
[0006] -种鹦鹉热嗜衣原体重组蛋白GST_CPSIT_p7的制备方法，包括以下步骤：
[0007] 步骤一：构建重组表达质粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7 :设计CPSIT_p7的特异性引物， 以Cps6BC菌株DNA为模板，PCR扩增CPSIT_p7编码基因，纯化PCR扩增产物后酶切连接到 载体 PGEX-6P-1 上；
[0008] 步骤二：诱导重组表达质粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7 :将重组表达质粒pGEX-6P-l/ CPSIT_p7转化至表达宿主菌中，并进行IPTG诱导表达；
[0009] 步骤三：制备重组蛋白GST-CPSIT_p7 :将表达产物PCR检测后经GST树脂纯化得 到GST-CPSIT_p7重组蛋白。
[0010] 所述步骤一构建重组表达质粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7,设计CPSIT_p7的特异性引 物：
[0011] 上游引物：5' -CGCGGATCCATGGGTAATTCTGGTTTTTACTT-3' ；
[0012] 下游引物：5' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTAACCATTTGTTTGTTGTTTTAC-3' ；
[0013] 对CPSIT_p7区进行预变性、变性、退火、延伸、30次循环，最后再延伸完成聚合 酶链式反应扩增，经琼脂糖电泳分离聚合酶链式反应产物，将得到的PCR扩增产物纯化 后经BamH I和Not I进行双酶切，用T4DNA连接酶于22°C连接3h后构建重组表达质粒 pGEX-6P-l/CPSIT_p7〇
[0014] 所述的聚合酶链式反应的反应条件是：对CPSIT_p7区进行94°C预变性5min后， 进入94°C变性30s，52°C退火45s，72°C延伸120s，30次循环，末次循环后72°C再延伸2min， 终止反应。
[0015] 所述的PCR扩增产物纯化，包括以下步骤：
[0016] a.平衡制备管：向制备管中加入200 yL GPS平衡液，2~5min后12000rpm离心 lmin，待用；
[0017] b.向PCR产物中加入4~5倍体积的CP Buffer，混匀后全部转移到平衡后的制 备管中，将所述制备管置于2ml离心管中，12000rpm离心lmin，弃清液；
[0018] c.将制备管放回 2ml 离心管，加 700 μ L DNA washing Buffer，12000rpm 离心 Imin，弃清液；
[0019] d.重复步骤c;
[0020] e.将制备管放回2ml离心管，12000rpm离心2min，弃清液；
[0021] f.将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管中央加入20-30 μ L Elution buffer或ddH20,静置2min，12000rpm离心Imin洗脱DNA，得到纯化后的PCR扩增产物。
[0022] 所述的步骤二中重组表达质粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7转化至表达宿主菌中，包括 以下步骤：
[0023] a·取10μL重组表达质粒pGEX-6P-l/CPSIT_p7加入200 μLE·coliBL21感受态 细胞中，轻轻旋转混合内容物，冰浴30min ;
[0024] b. 42°C热休克90s，立即冰浴2~3min ;
[0025] c.加入SOC培养基800 μ L，37°C温和振荡Ih ;
[0026] d. 1000 rpm离心5min，吸走600 μ L上清液，将菌液混勾后加入到含Ampicillin LB 固体培养基上，用接种环均匀涂布菌液，待水分充分吸收后37°C倒置培养并过夜，筛选阳性 克隆菌落。
[0027] 所述的步骤二中进行IPTG诱导表达，包括以下步骤：
[0028] 取筛选的所述阳性克隆菌落10 μ L，，接种到Ampicillin的LB固体培养基上，37°C 过夜培养，挑取单个阳性菌落于2mL含Ampicillin的LB液体培养基中，37°C水浴条件下， 振摇培养14h，同时设置空菌组和空质粒组作为对照组，并转种于4mL含Ampicillin LB液 体培养基，OD值为0. 5~0. 7时，加入IPTG诱导物至最终浓度为0. 2mM，30°C诱导表达4h， 同时设未诱导组作为对照组；取菌液1.0 mL 13000rpm离心30s，收集菌体沉淀，用PBS洗3 次，分别加入SDS凝胶加样缓冲液重悬，然后100°C水浴中温育5min，13000rpm离心5min。
[0029] 所述的步骤三中GST树脂纯化，包括以下步骤：
[0030] a.轻柔摇匀MERCK GST ^Bind树脂悬浊液吸取3ml树脂装柱，待树脂沉降后，将储 存20%乙醇缓冲液液面降到柱床上沿以下时，用5倍体积PBS洗树脂3遍；
[0031] b.待PBS流到柱床上沿以下，加入所述步骤二制备的表达产物的蛋白抽提液，室 温放置2h让树脂与蛋白充分结合，缓慢放掉未结合的蛋白；
[0032] c.以10倍体积PBS洗柱，收集洗涤液；
[0033] d.以 3 倍体积 IXGST Elution Buffer 洗脱得到重组蛋白 GST-CPSIT_p7〇
[0034] 一种鹦鹉热嗜衣原体重组蛋白GST-CPSIT_p7的用途，所述的重组蛋白 GST-CPSIT_p7可应用于检测鹦鹉热嗜衣原体感染的试剂盒中。
[0035] 所述重组蛋白GST-CPSIT_p7用作检测鹦鹉热嗜衣原体感染的试剂盒组分中的抗 原。
[0036] 所述抗原以胶体金或彩色胶乳标记。
[0037] 本发明的有益效果包括：
[0038] 1、本发明的一种鹦鹉热嗜衣原体重组蛋白GST-CPSIT_p7的制备方法使用的引 物，经多次实验和研宄表明其敏感性高，扩增出现的目的基因片段浓度大，其灵敏性明显高 于进行类似设计所得出的其他引物扩增的产物。
[0039] 2、本发明的一种鹦鹉热嗜衣原体重组蛋白GST-CPSIT_p