鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白及其ELISA试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，特别设及一种鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白及其ELISA试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸭疫里默氏杆菌巧iemerellaanatipestifer,RA)是一种革兰氏阴性菌，归于黄 杆菌科（Flavobacteriaceae)，是鸭疫里默氏杆菌病的病原体，能够引起鸭、鶴、火鸡和多种 禽类的一种慢性或急性败血症状的接触性传染疾病，呈世界性分布，发病率和死亡率高，已 成为目前严重危害养鸭业的主要传染病之一。该病的临床症状主要表现为精神沉郁，擁地、 缩颈、拉黄绿色稀便等症状；病变特征是引起宿主的纤维素性气囊炎、脑膜炎、屯、包炎、肝周 炎、W及干酪性输卵管炎，并伴有不同程度的败血症，对养殖业的发展存在着巨大的威胁。
[0003] 目前已建立的用于检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的方法有琼脂扩散试验、凝集试 验、全菌破碎作包被抗原的化ISA试验、PCR检测等。该些方法在检测方面都存在诸多不足 之处。如琼扩试验和凝集试验的灵敏度较低，特异性不高，只能检测个别血清；PCR检测虽 然灵敏但是在实际的生产当中运用难度大，需要专业的仪器和人员；破碎全菌的化ISA方 法虽然彰显了在化ISA检测方面的优势，但是作为包被抗原，在制备菌体抗原时细菌培养 要求高且在菌体抗原成分复杂、特异性等方面存在不足。
[0004] OmpH属于孔蛋白，目前未见鸭疫里默氏杆菌OmpH研究和应用的相关研究报道。
【发明内容】
[0005] 为克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种鸭疫里默 氏杆菌Om抑重组蛋白，该蛋白能作为鸭疫里默氏杆菌抗体的捕获剂，为鸭疫里默氏杆菌的 抗体检测提供了新思路。
[0006] 本发明的目的之二在于提供一种基于鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白的ELISA试 剂盒，可用于检测鸭疫里默氏杆菌的血清抗体，有着较高的敏感性、特异性和重复性。
[0007] 本发明的目的之=在于提供一种鸭疫里默氏杆菌抗体的检测方法，该方法操作简 单，适用于大规模应用。
[000引本发明的目的通过下述技术方案实现；一种鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白，其氨 基酸序列如SEQIDNO: 1所示。
[0009] 上述的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白的DM序列如SEQIDNO: 2所示。
[0010] 一种基于鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的化ISA试剂盒，所述化ISA试剂盒包 括固相支持物、抗体捕获剂、酶标二抗、底物、封闭液、终止液，所述抗体捕获剂为如SEQID NO: 1所示的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白。
[0011] 进一步，所述抗体捕获剂为浓度> 8. 0yg/mL的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白。
[0012] 进一步，所述酶标二抗为作400倍体积稀释的羊抗鸭IgG-HRP。
[0013] 用所述的化ISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法，所述方法还包括平行的 阴性实验，具体为：
[0014] A、将鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白与固相支持物连接，用封闭液封闭，洗漆去除 未结合的抗原及杂质，得固相抗原；
[0015]B、将待检血清通过保温反应使所述稀释血清与步骤A所得固相抗原结合形成固 相抗原抗体复合物，洗漆去除固相载体上杂质；
[0016] C、将所述酶标二抗与所述固相抗原抗体复合物结合，得抗原一抗体一二抗复合 物；
[0017] D、在步骤C所得抗原一抗体一二抗复合物加入底物显色液避光显色后，加入终止 液终止反应得显色样品液；
[001引E、将步骤D所述显色样品液用酶标仪测0D450皿值，待检血清的0D450皿值> 阴 性样品0D450nm值的临界值（即X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性，其中X为阴性样品 0D450nm值的均值，SD为阴性样品0D450nm值的标准方差。
[0019] 进一步，所述的化ISA试剂盒检测鸭疫里默氏杆菌抗体的方法具体为：
[0020] 1)将浓度>8.0yg/血的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白与固相支持物连接，用封 闭液封闭，洗漆去除未结合的抗原及杂质，得固相抗原；
[0021] 2)将待检血清作100倍稀释得稀释血清，通过保温反应使所述稀释血清与步骤1) 所得固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，洗漆去除固相载体上杂质；
[0022] 3)将羊抗鸭IgG-HRP作400倍体积稀释后的酶标二抗稀释液与所述固相抗原抗体 复合物结合，得抗原一抗体一二抗复合物；
[0023] 4)在步骤3)所得抗原一抗体一二抗复合物加入底物显色液避光显色后，加入终 止液终止反应得显色样品液；
[0024] 5)将步骤4)所述显色样品液用酶标仪测0D450nm值，待检血清的0D450nm值> 0. 37时则为阳性，反之则为阴性。
[0025] 进一步，步骤1)中所述鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白、步骤2)中所述稀释血清 及步骤3)中所述酶标二抗稀释液的加入量为等体积。
[0026] 本发明的有益效果在于：鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白是选取鸭疫里默氏杆菌 (RA)Om抑全基因编码蛋白；然后利用基因工程技术，在对Om抑全基因克隆的基础上，将其 与原核表达载体祀T-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌化2UDE3)表达系统进行诱导、表达 的基因工程产品。该蛋白的表达形式是OmpHAlis可溶性融合蛋白，表达的融合蛋白分子量 为38kDa，将产品设计为融合表达主要是考虑便于纯化；同时表达蛋白为可溶性表达形式， 在蛋白的制备、纯化过程中避免了蛋白的变性、复性等过程，利于保持蛋白的天然活性。经 原核表达系统表达后的产品经Westernblot进行鉴定后表明具有与天然蛋白相似的免疫 反应活性；本发明运用纯化后的OmpHAlis融合蛋白作为包被抗原，建立了ELISA检测试剂 盒，该方法可用于几种不同血清型鸭疫里默氏杆菌血清抗体的检测，具有重复性好、敏感度 高、特异性强等特点。
[0027] 采用本发明的方法生产的产品可用于：
[002引①本产品中OmpH重组蛋白可作为检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的间接化ISA方 法等中的检测抗原。
[0029] ②本产品中间接化ISA试剂盒可用于临床鸭血清样本中鸭疫里默氏杆菌抗体的 检测。
[0030] 本发明的产品优点体现在：
[0031] ①由于该检测抗原是鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋白，并非全菌，因此应用该检测 抗原进行检测时无散毒危险。
[0032] ②本发明可W用于鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC11845、RA-CH-1和RA-CH-2不同血清 型的抗体检测。
[0033]⑨检测鸭疫里默氏杆菌抗体，特异性强、重复性好、灵敏度高。
[0034] ④性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。
【附图说明】
[003引图1为OmpH基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。其中1为OmpH基因PCR扩增 产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带；M为DNAMarker。
[0036] 图2为重组质粒pMD19-〇mpH的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DMMarker; 1和2 为重组质粒pMD19-〇mpH用BamHI和化0I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的 两条特异性条带。
[0037] 图3为祀T32a-〇mpH的酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNAMarker;1 和2为重组表达质粒祀T32a-〇mpH用BamHI和化0I双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳 所获得的两条特异性条带。
[003引图4为重组表达质粒祀T32a-0mpH表达的鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白在37°C、IPTG浓度为0. 4mmo1/L的条件下诱导表达过夜的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质 Marker;1为重组表达质粒祀T32a-0mpH用IPTG诱导，得到的菌液超声波破碎、离屯、后，所 得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果；2为重组表达质粒祀T32a-0mpH用IPTG诱导，得到的菌 液进行超声波破碎、离屯、后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果；3为空载体祀T-32a(+) 用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果。
[0039] 图5为37°C时不同IPTG浓度下含有重组质粒祀T32a-〇mpH的宿主菌E.coli BL2UDE3)诱导表达4小时后鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中， M为蛋白质Marker;1为IPTG的终浓度为Ommol/L;2为IPTG的终浓度为0. 4mmol/L;3为 IPTG的终浓度为0. 8mmol/L;4为IPTG的终浓度为1. 2mmol/L。
[0040] 图6为不同温度下IPTG浓度为0. 4mmol/L时含有重组质粒祀T32a-〇mpH的宿主 菌E.coliBL21 〇)E3)诱导表达4小时后表达鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的SDS-PAGE 电泳图。其中，M为蛋白质Marker;1为诱导温度为25°C;2为诱导温度为30°C;3为诱导温 度为37°C。
[0041] 图7为37°C和IPTG浓度为0. 4mmol/L时不同诱导时间下含有重组质粒 pET32a-〇m抑的宿主菌E.coliBL21 〇)E3)表达鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白的SDS-PAGE 电泳图。其中M为蛋白质Marker;1为诱导化；2为诱导化；3为诱导化；4为诱导化。
[0042] 图8为镶琼脂糖凝胶（Ni2+-NAT)亲和层析纯化后的鸭疫里默氏杆菌Om抑重组蛋 白SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker;1为经镶琼脂糖凝胶亲和层析纯化后的OmpH 重组蛋白；2为Img/mlBSA。
[004引图9为鸭疫里默氏杆菌OmpH重组蛋白Western-blot图。其中M为预染蛋白质 Marker;1为OmpH重组蛋白的免疫印迹条带。
[0044] 图10为鸭疫里默氏杆菌玻片凝集试验结果图。在1:2、1:4、1:8和阳性对照孔里 分别有细沙状凝集颗粒；1:16孔内没有凝集颗粒。
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