一种汞-极低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及重金属离子的免疫学检测，具体设及一种隶-极低密度脂蛋白馨合物 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复 合物，按密度分为高密度脂蛋白化i曲densitylipoprotein,简称皿L)、中间密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein,简称IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,简称LDL)、极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,简称VLDL)、 乳糜颗粒（chylomicron,CM)。血液中大约百分之S十的胆固醇是通过皿L从组织细胞中 运输到肝脏转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。血液中约70%的胆固醇由LDL和VLDL 所携带，肝脏中产生的内源性甘油S醋（triglyceride,TG)也主要依靠VLDL运输至肝外。 VLDL的增多与高脂血症、脂代谢素乱息息相关，而血脂异常又是多种疾病发生的重要危险 因素，因而VLDL含量水平的稳定对于人体各方面机能功能的稳定起着重要作用。
[0003] VLDL含量水平及结构功能的稳定对机体意义重大。其含量过高与脂肪肝、脂代谢 素乱、屯、血管疾病、肾脏功能损伤等息息相关。定量检测VLDL可W用于该些疾病的早期诊 断W及治疗效果监测，甚至作为预后好坏的评价指标之一。而对于营养不良、慢性贫血、肝 功能受损者等患者，血清VLDL含量也会下降，定量检测VLDL也可用于该些疾病的早期诊 断、治疗效果监测W及作为预后评价的指标之一。
[0004] 隶（Mer州巧，Hg)是一种无处不在的重金属，广泛应用于工业、农业、医药业，是 一种非常重要的环境污染物。2011年，美国毒物和疾病登记署扣nitedStatesAgency forToxicSubstancesandDiseaseRegistry,ATSDR)已将其列入物质优先列表内 (SubstancePriorityList),而世界卫生组织（WorldHealthOrganization,WHO)也早已 将其列为10大最易引起健康问题的化学品之一。
[0005] 隶被认为是对人体及其有害的，会影响人体的多个组织、器官及系统，包括屯、血管 系统、呼吸系统、神经系统、内分泌系统、消化系统、泌尿系统、免疫系统等，对人体危害极 大。关于隶致机体损伤的机制及其复杂，是很多学者及专家的研究中屯、。目前普遍研究认 为隶是一个具有其极强的琉基结合能力的金属，因此推测其与多种蛋白质之间关系密切。 众所周知，蛋白质作为身体多种功能的执行者，与机体各组织、器官功能的稳定息息相关， 而隶作为一种金属与机体内的多种蛋白质皆关系密切，相信隶与蛋白质之间的相互关系与 隶致机体损伤息息相关，研究隶与蛋白质的关系将有助于我们了解隶致机体损伤的具体机 制。
[0006] 隶是一种强有力的琉基结合剂，隶也表现出对氨基、磯酷基、駿基及哲基团巨大的 亲和力。因此，隶可W广泛地结合多种蛋白质，并影响他们的功能，抑制他们的活性。随着 对隶毒性研究的深入，人们逐渐认识到隶与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的 角色，被认为是了解隶的毒性机理的关键所在，因此，对隶和蛋白质相互作用的研究就显得 愈发重要。而现在关于隶与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与隶之间的 关系还不清楚，因而加强研究对于隶与蛋白质之间的关系至关重要。
【发明内容】
[0007] 针对隶污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种隶-极低密度脂蛋白馨合物 及其制备方法，并建立隶-极低密度脂蛋白馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测 隶-极低密度脂蛋白馨合物在评价一个地区隶污染程度的应用。通过定量检测一个地区人 群血清中隶-极低密度脂蛋白馨合物，可W间接反映该个地区人群受隶污染的情况，从而 间接反映该个地区隶污染程度。
[000引本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种隶-极低密度脂蛋白馨合 物，该隶-极低密度脂蛋白馨合物是隶离子与极低密度脂蛋白通过琉基或/和半脱氨酸残 基馨合而成。
[0009] 本发明还提供一种上述的隶-极低密度脂蛋白馨合物的制备方法，即体外合成 法，包括W下步骤：
[0010] A)隶-极低密度脂蛋白馨合物的合成；在提纯源于人体的极低密度脂蛋白或按照 生物学方法重组的极低密度脂蛋白中加入隶离子进行馨合反应，得到反应溶液；
[0011] B)隶-极低密度脂蛋白馨合物纯化；采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液 中未反应的极低密度脂蛋白、特异性抗体和隶离子，即得隶-极低密度脂蛋白馨合物。
[0012] 作为优选，所述步骤B)中具体包括W下步骤：
[0013] (1)溶解样品；将上述步骤A)的隶-极低密度脂蛋白馨合物溶解于生理盐水中， 得隶-极低密度脂蛋白馨合物的溶液；
[0014] (2)平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与极低 密度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[00巧]做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使极低 密度脂蛋白与填料特异性结合；
[0016] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[0017] (5)收集；收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0018] (6)透析；将步骤巧）中的收集的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次 后，4°C透析过夜，收集样本；
[0019] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与隶特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0020] (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱；
[0021] (9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[0022] (10)收集；收集步骤巧）的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[002引 （11)透析；将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用(1化0透析除盐，换水立次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得隶-极低密度脂蛋白馨合物。
[0024] 作为优选，上述隶-极低密度脂蛋白馨合物的制备方法，还包括W下对隶-极低密 度脂蛋白馨合物的鉴定步骤，具体包括w下步骤：
[0025] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[002引 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的隶-极低密度脂蛋白馨合物，加入上样缓 冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[0027] 做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0028] (4)检测；在胶床上找出含有隶的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶 解，然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有隶W及检测隶的含量。
[0029] 本发明还提供一种如上述的隶-极低密度脂蛋白馨合物在制备检测人体内隶-极 低密度脂蛋白馨合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0030] 本发明还提供一种至少包括如上述的隶-极低密度脂蛋白馨合物作为标准品的 试剂盒。
[0031] 优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获极低密度脂蛋白的物质或 捕获金属隶的物质。
[0032] 本发明还提供一种定量检测隶-极低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的上 述的隶-极低密度脂蛋白馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免 疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯 隶-极低密度脂蛋白馨合物与酶联免疫结合法、提纯隶-极低密度脂蛋白馨合物与原子吸 收光谱结合法、提纯隶-极低密度脂蛋白馨合物与电感禪合等离子体质谱结合法、电泳与 酶联免疫或原子吸收光谱或电感禪合等离子体质谱结合法。
[0033] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0034] 1.本发明首次合成了隶-极低密度脂蛋白馨合物；
[0035] 2.本发明首次提出隶-极低密度脂蛋白馨合物可用于制备检测血样中隶-极低密 度脂蛋白馨合物的试剂或试剂盒中的应用；
[0036] 3.本发明实现了隶-极低密度脂蛋白馨合物的特异性识别和定量检测，W便定量 检测人群血清中隶-极低密度脂蛋白馨合物的含量，W评价一个地区隶污染程度的应用， 为工业地区的隶污染水平提供间接指标。本发明建立的隶-极低密度脂蛋白馨合物定量检 测方法的准确度高、重复性好。
【附图说明】
[0037]图1为本发明所述的隶-极低密度脂蛋白馨合物的非变性电泳条带图；
[003引图2为本发明所述的隶-极低密度脂蛋白馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光 分析图。
【具体实施方式】
[0039] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0040] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材 料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
[0041] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0042] 捕获极低密度脂蛋白的物质为抗极低密度脂蛋白抗体，可通过市售获得，W下实 施例中，使用的抗极低密度脂蛋白抗体为"Genetex gtxl6419"的VLDL antibody,所述与极 低密度脂蛋白特异性结合的物质、抗极低密度脂蛋白抗体、抗VLDL抗体均为捕获极低密度 脂蛋白的物质；
[0043] 酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磯酸酶等酶标记的抗体中的一种；
[0044] 稀释缓冲液为抑9.6的0. 05M碳酸盐缓冲液，配制方法示例：取1. 5g的化化和 2. 93g的Na肥〇3溶解加d地2〇定容至1000血；
[0045] 洗漆缓冲液为抑7. 4的0. 15MPBS溶液，配制方法示例：取0. 2g的皿2口〇4、2. 90g 的化2册〇4? 12&0、8.Og的NaCl、0. 2g的KC1、0. 5mLTween-20,溶解加dd&O定容至 1000血；
[0046] 封闭液为牛血清白蛋白溶液，配制方法示例：取0.Ig牛血清白蛋白，加入洗漆缓 冲液稀释定容至lOOmL;
[0047] 终止液为2MH2SO4,配制方法示例：取17