一种铬-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及重金属离子的免疫学检测，具体设及一种铭-低密度脂蛋白馨合物及 其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 脂蛋白（lipoproteins)是蛋白质与脂质结合所形成的一种脂质-蛋白质复 合物，按密度分为高密度脂蛋白化i曲densitylipoprotein,简称皿L)、中间密度脂 蛋白（intermediatedensitylipoprotein,简称IDL)、低密度脂蛋白（lowdensity lipoprotein,简称LDL)、极低密度脂蛋白（verylowdensitylipoprotein,简称VLDL)、 乳糜颗粒（chylomicron,简称CM)。
[0003] 血液中大约百分之=十的胆固醇是通过高密度脂蛋白从组织细胞中运输到肝脏 转化为胆汁酸或通过胆汁排出体外的。血液中约70%的胆固醇由LDL和VLDL所携带，而 LDL所携带的胆固醇含量大于VLDL由于LDL富含胆固醇，因而被称为"坏胆固醇"。其与多 种疾病的发生、发展密切相关，特别是冠屯、病，糖尿病等疾病，研究发现LDL升高是动脉粥 样硬化发生、发展的必备条件。2014年，CE化REPORTS报道，"坏胆固醇"还可促进癌症细 胞的发展和转移。
[0004]LDL是动脉粥样硬化发生和发展的主要危险因素，其改变在血清蛋白中有很强的 影响动脉粥样硬化作用，是冠状动脉疾病的重要危险因子，与屯、血管疾病危险程度呈正相 关。因而定量检测血清中LDL对于屯、血管疾病具有重要意义，不仅可W用于早期识别动 脉粥样硬化的危险性，而且可W作为降脂药物治疗过程的检测W及预后评价的指标之一。 此外，其他一些疾病，诸如：肾病综合征、慢性肾功能衰竭、肝病及糖尿病等，也可使血清中 LDL含量上升，而定量检测LDL也可用于该些疾病的早期诊断W及治疗效果监测，甚至作为 预后好坏的评价指标之一。而对于营养不良、慢性贫血、骨髓瘤、急性屯、肌梗死、创伤和严重 肝病等患者，血清LDL的含量将会下降，定量检测LDL也可用于该些疾病的早期诊断、治疗 效果监测W及作为预后评价的指标之一。
[0005] 铭（C虹omium，化）是元素周期表VI族中的一种过渡金属，其质地坚硬，表面具有 光泽，有较高的烙点，在工业生产中具有重大的经济价值，一个世纪W来被广泛应用，每年 全球铭生产量高达107吨，因而铭是一种名副其实的重要金属污染物。目前，铭广泛应用于 电锻、踩革、颜料、油漆、合金、印染等各个方面，与人们的生活息息相关，但是同样也对人 类的身体健康产生巨大影响。
[0006]自然界中铭主要价和六价的形式存在，而一般认为，=价铭是人类所需的微 量元素，而六价铭才是明显的毒性物质。由于六价铭易通过细胞膜进入细胞，而且可W通过 一系列反应，产生强烈的细胞毒性及基因毒性，因而普遍认为六价铭的毒性高于=价铭，达 10-100倍。学者认为当水中的六价铭含量超过0.05mg/L即是有毒的。六价铭可W通过皮 肤接触、食物摄入、饮用水饮入、呼吸道吸入等途径进入人体，对于职业性暴露人群主要是 通过呼吸道吸入六价铭灰尘，而对于普通人群则是通过饮入污染水源、食入被污染的食物、 吸入等方式摄入六价铭。六价铭进入体内后，可w引发氧化应激、显色体崎变、细胞调亡、多 种DNA损伤（包括单链断裂、DNA-蛋白质交联、DNA-氨基酸交联、化-DNA配合物形成等）， 从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。
[0007] 如前所述，铭与多种蛋白质之间关系密切，可W与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白 酶的活性。随着对铭毒性研究的深入，人们逐渐认识到铭与蛋白的相互作用在其致毒过程 中扮演着重要的角色，被认为是了解铭的毒性机理的关键所在，因此，对铭和蛋白质相互作 用的研究就显得愈发重要。而现在关于铭与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋 白质与铭之间的关系还不清楚，因而加强对于铭与蛋白质之间的关系至关重要。
[0008] 关于铭中毒，特别是慢性铭中毒的评价，通过检测血铭含量也不能准确评价人体 内的循环铭含量，无法进一步评估铭对于机体功能的损伤程度，而随着科学技术的飞速发 展，铭与人体的关系也日益紧密，因而寻找一种可W从免疫功能角度评价铭中毒，特别是慢 性铭中毒对于机体的损害程度的评价方式日益重要。
【发明内容】
[0009] 针对铭污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铭-低密度脂蛋白馨合物及 其制备方法，并建立铭-低密度脂蛋白馨合物的定性、定量检测方法，W便定量检测铭-低 密度脂蛋白馨合物在评价一个地区铭污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中 铭-低密度脂蛋白馨合物，可W间接反映该个地区人群受铭污染的情况，从而间接反映该 个地区铭污染程度。
[0010] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种铭-低密度脂蛋白馨合 物，该铭-低密度脂蛋白馨合物是铭离子与低密度脂蛋白馨合物通过琉基或/和半脱氨酸 残基馨合而成。
[0011] 本发明还提供一种上述的铭-低密度脂蛋白馨合物的制备方法，即体外合成法， 包括W下步骤：
[0012]A)铭-低密度脂蛋白馨合物的合成；在提纯源于人体的低密度脂蛋白或按照生物 学方法重组的低密度脂蛋白中加入铭离子进行馨合反应，反应溶液；
[0013] B)铭-低密度脂蛋白馨合物纯化；采用免疫亲和层析法，去除步骤A)反应溶液中 未反应的低密度脂蛋白、特异性抗体和铭离子，即得铭-低密度脂蛋白馨合物。
[0014] 作为优选，所述步骤B)中具体包括W下步骤：
[0015] (1)溶解样品；将上述步骤A)的铭-低密度脂蛋白馨合物溶解于生理盐水中，得 铭-低密度脂蛋白馨合物的溶液；
[0016] (2)平衡层析柱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与低密 度脂蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0017]所述能与低密度脂蛋白特异性结合的填料为吸附有可与低密度脂蛋白特异性结 合物质的硅胶或树脂；
[001引 做上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1)的溶液，然后上柱，使低密 度脂蛋白与填料特异性结合；
[0019] (4)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[0020] (5)收集；收集步骤（4)的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0021] (6)透析；将步骤巧）的洗脱液，装透析袋，用d地2〇透析除盐，换水S次后，4°C透 析过夜，收集样本；
[0022] (7)平衡层析柱；采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能 与铭特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
[0023] 所述能与铭特异性结合的填料为吸附有可与铭特异性结合物质的硅胶或树脂；
[0024] (8)上样；待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤化）中样本，然后上柱；
[00巧](9)洗脱；使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的 化2册〇4溶液进行洗脱；
[0026] (10)收集；收集步骤巧）的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复原；
[0027] (11)透析；将步骤（10)的洗脱液，装透析袋，用dd&O透析除盐，换水立次后，4°C 透析过夜，收集样本，即得铭-低密度脂蛋白馨合物。
[002引作为优选，上述铭-低密度脂蛋白馨合物的制备方法，还包括W下对铭-低密度脂 蛋白馨合物的鉴定步骤，具体包括W下步骤：
[0029] (1)制备胶床；W琼脂糖凝胶、聚丙締酷胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；
[0030] 似加样；取步骤B)中提取纯化得到的铭-低密度脂蛋白馨合物，加入上样缓冲 液，并混匀，然后加样于样品槽中；
[00引]做电泳：连接电泳板，进行电泳；
[0032] (4)检测；在胶床上找出含铭的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带溶解， 然后再采用ICP-MS或AAS检测是否含有铭W及检测铭的含量。
[0033] 本发明还提供一种如上述的铭-低密度脂蛋白馨合物在制备检测人体内铭-低密 度脂蛋白馨合物的试剂或试剂盒中的应用。
[0034] 本发明还提供一种至少包括如上述的铭-低密度脂蛋白馨合物作为标准品的试 剂盒。
[00巧]优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获低密度脂蛋白的蛋白或捕 获金属铭的物质。
[0036] 本发明还提供一种定量检测铭-低密度脂蛋白馨合物的方法，W已知含量的上述 的铭-低密度脂蛋白馨合物作为标准品，采用W下方法之一对样品进行检测；酶联免疫法、 酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感禪合等离子体质谱结合法、提纯铭-低 密度脂蛋白馨合物与酶联免疫结合法、提纯铭-低密度脂蛋白馨合物与原子吸收光谱结合 法、提纯铭-低密度脂蛋白馨合物与电感禪合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原 子吸收光谱或电感禪合等离子体质谱结合法。
[0037] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[003引1.本发明首次合成了铭-低密度脂蛋白馨合物；
[0039] 2.本发明首次提出铭-低密度脂蛋白馨合物可用于制备检测血样中铭-低密度脂 蛋白馨合物的试剂或试剂盒中的应用；
[0040] 3.本发明实现了馨合型低密度脂蛋白的特异性识别和定量检测，W便定量检测人 群血清中铭-低密度脂蛋白馨合物的含量，W评价一个地区铭污染程度的应用，为工业地 区的铭污染水平提供间接指标。本发明建立的铭-低密度脂蛋白馨合物定量检测方法的准 确度高、重复性好。
【附图说明】
[0041]图1为本发明所述的铭-低密度脂蛋白馨合物的非变性电泳条带图；
[0042]图2为本发明所述的铭-低密度脂蛋白馨合物的电泳条带的同步福射X线巧光分 析图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合【具体实施方式】，对本发明做进一步描述：
[0044] 本发明除特别说明外，设及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤；所用试剂、材 料如未特殊说明，均视为可从市购方式购得：
[0045] 提取试剂为PEG溶液、棚酸盐缓冲液等（采用PEG法）；
[0046] 捕获低密度脂蛋白的蛋白为抗低密度脂蛋白抗体，可通过市售获得，如货号为 "Abeamabl57795"的anti-LDL抗体，W下实施方式中，所述与低密度脂蛋白特异性结合的 物质、抗低密度脂蛋白抗体、抗LDL抗体均为捕获低密度脂蛋白的蛋白；
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