一种获得干酪发酵剂的菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及乳制品领域，具体设及一种获得干酪发酵剂的菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 干酪，又名奶酪，有各式各样的味道、口感和形式。干酪W奶类为原料，含有丰富的 蛋白质和脂质，具有很高的营养价值。随着我国人民生活水平的提高，对干酪的需求量越来 越多。在干酪生产和成熟过程中微生物菌群起着重要的作用，促进了产品的质构和风味的 形成。干酪的干酪发酵剂对干酪质构和特征风味的形成起了极其重要的作用。干酪发酵剂 在干酪生产过程中产酸，能够提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清、抑制有害细菌生长，并 产生各种酶参与干酪特征风味与质构的形成。
[0003] 大多数干酪的生产需要在凝乳前添加不同种类的乳酸乳球菌（Lacticacid bacteria,LAB),它们的主要作用是在干酪制作过程中产酸，干酪生产过程中一个关键点即 为乳酸乳球菌乳糖代谢为乳酸，其酸化的速度和程度影响凝乳的效果和干酪得率并影响凝 乳酶的活性。LAB有时也能够产生己酸、己醒和双己酷等风味物质。发酵剂一般可W分为 两类，嗜温性发酵剂（即最适温度为30°C)和嗜热性发酵剂（即最适温度为42°C)。嗜温 性发酵剂中通常包含乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)和明串珠菌（Leuconostocspp.) 等，嗜热性发酵剂通常包括嗜热链球菌（Str巧tococ州sthermophilus)和保加利亚乳杆菌 (Lactobacillusbulgaricus)等。现今使用的大部分发酵剂直接由凝乳再次培养而得，而 该些凝乳本身是经过长期的大规模优质干酪的生产实践中挑选出来的，通常含有2~6株 菌，所W在某种程度上，目前大部分的发酵剂可被称为混合发酵剂。国内在发酵剂方面的研 究主要集中于适用于酸奶的嗜热性发酵剂。
[0004] 目前，国内对嗜温新的发酵剂研究很少，主要热衷于酸奶发酵剂（主要是嗜热性 乳酸乳球菌）的筛选及制备的研究，而对可用于干酪生产的嗜温性乳酸乳球菌的筛选研究 较少，对于干酪用菌体系的筛选标准及方法更是空白。因此，利用中国丰富的菌种资源开发 适用于全新的干酪发酵剂的发酵菌株具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对目前缺乏难W将快速产酸型干酪发酵剂和产 香型干酪发酵剂有效结合W制备出应用于干酪制备的干酪发酵剂的不足，提供一种获得干 酪发酵剂的菌株的方法，所述的方法简便易行的、重复性高，能够选择出合适的、能够共生 的乳酸乳球菌菌株和明串珠菌，从而用于结合快速产酸和产香型的干酪发酵剂的制备中。
[0006] 本发明提供一种获得干酪发酵剂的菌株的方法，其包括W下的步骤：
[0007](1)、将活化的乳酸乳球菌（Lactococcuslactis)接种于含有3~5%氯化钢、 pH4~5的10~12%脱脂乳培养基中，28~35°C培养12~20小时得培养液a,通过平板 计数法选择活菌总数a> 106c化/mL的菌株，所述百分比为质量百分比；
[000引 （2)、将步骤（1)获得的菌株接种于10%~12%脱脂乳培养基中，分别在13~ 16°C培养12~20小时，得培养液b;28~32°C培养12~20小时，得培养液c;在28~ 32°C培养12~16小时后39~41°C水浴2小时，得培养液d;通过平板计数法选择培养液 b中活菌总数b> 105c化/mL、培养液C中活菌总数C> 107c化/mL;且培养液d中106c化/ 血 >活菌总数d> 104c化/血的菌株，即乳酸乳球菌菌株类I，所述百分比为质量百分比；
[0009] 将所述乳酸乳球菌菌株类I在10~12%脱脂乳培养基中28~32°C培养24小时， 得培养液e，选择pH值低于4. 8、培养9~24小时后凝乳且光密度值ODee。^ 0. 7的培养液 e所对应的菌株为乳酸乳球菌菌株A;
[0010](3)、将活化的肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides)接种于10~12%脱脂 乳培养基中，28~35 °C培养24~36小时后，选择凝乳且香味浓郁的肠膜明串珠菌菌株B， 所述百分比为质量百分比；
[0011] (4)、将步骤（2)所得的乳酸乳球菌菌株A和步骤（3)所得的肠膜明串珠菌菌株B 共同接种于10~12%脱脂乳培养基中，28~32°C培养至凝乳得发酵液f，选择满足W下条 件的所述发酵液f;所述发酵液f的pH值低于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A 和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的抑值，且所述发酵液f的光密度值0化。。高于 相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的光 密度值〇化。。，所选择的所述发酵液f所对应的菌株即为用于干酪发酵剂的菌株。
[0012] 所述的乳酸乳球菌为本领域常规的乳酸乳球菌，较佳地为乳酸乳球菌乳酸亚种 (Lactococcuslactissubsp.lactis)。
[001引步骤（1)为；将活化的乳酸乳球菌接种于含有3~5%氯化钢、pH4~5的10~ 12%脱脂乳培养基中，28~35°C培养12~20小时得培养液a,通过平板计数法选择活菌总 数a> 106c化/mL的菌株，所述百分比为质量百分比。其中，所述的活化为本领域常规的活 化，较佳地，其包括W下的步骤；将所述的菌株接种于活化培养基28~32°C培养16~32小 时即可。所述的接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1~2%，所述百分比为体 积百分比。所述的活化培养基为本领域常规的培养基，能够使乳酸乳球菌活化即可，较佳地 为M17肉汤培养基。所述氯化钢的含量为3~5%，较佳地为4~4. 5%，所述百分比为质 量百分比。所述抑为4~5,较佳地为4. 5~5。所述培养的温度为28~35°C，更佳地为 28~32°C。所述培养的时间为12~20小时，更佳地为12~16小时。所述脱脂乳培养基 由脱脂乳粉溶解于水中混合得到，所述百分比为所述脱脂乳粉占所述脱脂乳粉和所述水总 质量的质量百分比。所述平板计数的培养基为本领域常规，较佳地为平板计数琼脂培养基 (PCA)，所述PCA的成分和配制方法参见GB4789. 2-2010。所述平板计数中培养的温度为本 领域常规的温度，较佳地为36~38°C。所述平板计数中培养的时间为本领域常规的时间， 较佳地为48小时。所述平板计数的方法为本领域常规的方法，较佳地参见GB4789. 2-2010。
[0014]步骤（2)为；将步骤（1)获得的菌株接种于10%~12%脱脂乳培养基中，分别在 13~16°C培养12~20小时，得培养液b;28~32°C培养12~20小时，得培养液C;在28~ 32°C培养12~16小时后39~4rC水浴2小时，得培养液d;通过平板计数法选择培养液 b中活菌总数b> 105c化/mL、培养液C中活菌总数C> 107c化/mL;且培养液d中106c化/ 血 >活菌总数d> 104c化/血的菌株，即乳酸乳球菌菌株类I，所述百分比为质量百分比； 将所述乳酸乳球菌菌株类I在10~12%脱脂乳培养基中28~32°C培养24小时，得培养 液e，选择抑值低于4. 8、培养9~24小时后凝乳且光密度值ODee。^ 0. 7的培养液e所对 应的菌株为乳酸乳球菌菌株A。
[0015] 其中，所述的接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地1~2%，所述百分 比为体积百分比。所述平板计数的培养基为本领域常规，较佳地为平板计数琼脂培养基 (PCA)，所述PCA的成分和配制方法参见GB4789. 2-2010。所述平板计数中培养的温度为本 领域常规的温度，较佳地为36~38°C。所述平板计数中培养的时间为本领域常规的时间， 较佳地为48小时。所述平板计数的方法为本领域常规的方法，较佳地参见GB4789. 2-2010。 较佳地，选择抑值低于4. 8、培养9~24小时后凝乳、具有新鲜酸味、无异味且光密度值 ODee。^ 0. 7的培养液e所对应的菌株为乳酸乳球菌菌株A。
[0016] 步骤（3)为；将活化的肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides)接种于10~ 12%脱脂乳培养基中，28~35°C培养24~36小时后，选择凝乳且香味浓郁的肠膜明串珠 菌菌株B，所述百分比为质量百分比。其中，所述的活化为本领域常规的活化，较佳地，其包 括W下的步骤；将所述的菌株接种于活化培养基28~32°C培养16~32小时即可。所述的 接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1~2%，所述百分比为体积百分比。所述 的活化培养基为本领域常规的培养基，能够使乳酸乳球菌活化即可，较佳地为添加4~5% 庶糖的M17肉汤培养基，所述的百分比为质量百分比。所述培养的温度为28~35°C，较佳 地为28~32 °C。
[0017] 步骤（4)为；将步骤（2)所得的乳酸乳球菌菌株A和步骤（3)所得的肠膜明串珠菌 菌株B共同接种于10~12%脱脂乳培养基中，28~32°C培养至凝乳得发酵液f，选择满足 W下条件的所述发酵液f;所述发酵液f的pH值低于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌 菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液的抑值，且所述发酵液f的光密度值0化。。 高于相同条件下单独培养所述乳酸乳球菌菌株A和所述肠膜明串珠菌菌株B所得的发酵液 的光密度值〇化。。，所选择的所述发酵液f对应的菌株即为用于干酪发酵剂的菌株。其中，所 述的接种的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1~2%，所述百分比为体积百分比。
[0018] 根据本发明，步骤（1)所述培养液a中的菌株在平板计数琼脂培养基上的菌落形 态为；菌落呈乳白色，菌落较小，圆形凸起，有光泽，菌体卵圆形。之后迅速生长，2天后菌落 大而紧密，呈乳白色略带黄色。说明其能够在干酪成熟环境下生长良好。而满足步骤（2) 所述的活菌总数条件则能够证明乳酸乳球菌菌株在制备过程中各个步骤的不同温度要求 下均满足生长良好的要求，从而发挥干酪发酵剂的作用。
[0019] 根据本发明，步骤（2)乳酸乳球菌菌株A和步骤（3)所得的肠膜明串珠菌菌株B 均非某一种特定的菌株，并且乳酸乳球菌菌株A和肠膜明串珠菌菌株B能够通过培养基的 配制和发酵获得，重复性好，具有很高的实用性。
[0020] 根据本发明，步骤（4)的生长良好的乳酸乳球菌菌株和肠膜明串珠菌菌株，能够 在干酪成熟环境下良好生长，其中乳酸乳球菌菌株有优良的产酸能力和产黏能力，而肠膜 明串珠菌菌株有优异的产香能力，两者的组合中菌株之间具有良好的互生作用，能够比单 独生长时产酸速度更快、菌株生长量更高，因此可W用于干酪发酵剂的生产，尤其是干酪发 酵剂的生产。
[0021]本发明所述的方法可操作性强，重复性好。利用本发明所述的方法将保存的41株 乳酸乳球菌和47株肠膜明串珠菌进行了检测，获得了适合制备干酪用干酪发酵剂的5株乳 酸乳球菌和3株肠膜明串珠菌，说明