脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物工程、组织工程和生物医药领域，特别设及利用厮带间充质干细 胞诱导转化为膜岛细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是膜岛素分泌相对或绝对不足或膜岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白 质代谢素乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射膜岛素来治疗。而细 胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失膜岛细胞功能的糖 尿病患者来说，植入能分泌膜岛素的膜岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，膜岛 细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难 极大的限制了该种疗法的应用。
[0003] 干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想祀细胞。干 细胞分为全能干细胞（如胚胎干细胞，可W分化为机体所有组织细胞）、多能干细胞胞（具 有多向分化潜能，可W分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等）和专能干细胞（维持某一 特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等）。干细胞技术的不断突破及干细胞 本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的 各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程W供临床所需，W此为目的的干细胞工程设 及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如屯、血管疾病、糖尿病、恶性 肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于 人羊水、厮带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优 点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的 作用。
[0004] 对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌膜岛素的细胞，是治疗I型糖尿 病的理想策略之一。目前，现有技术中已出现诱导干细胞转化为膜岛细胞的方法，即应用 插入式细胞培养皿共培养板体外诱导厮带间充质干细胞向膜岛样细胞分化具体为；选取 第3代厮带间充质干细胞，用含10%FBS(胎牛血清）的L-DMEM培养基重悬细胞，调整细 胞密度为1X105个/ml,接种于普通6孔板，倒置显微镜下观察细胞贴壁后，改为L-DMEM/ RPMI1640(1:1)培养基（低糖型改良杜氏伊格尔培养基与RPMI16401:1混合而成的培养 基）。同时将已分离获得的膜岛细胞，W50个/孔接种于共培养板的中，进行厮带间充质干 细胞和膜岛细胞两种细胞的共培养。然而，此种共培养方法不仅需要一定的膜岛细胞源，过 程较繁琐，花费较大，而且所获得的更多为散在膜岛样细胞，数量较少，膜岛细胞团几乎没 有，而且散在的膜岛样细胞相对较小，膜岛素分泌量少难W达到临床移植要求。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中干细胞与膜岛细胞共培养方式所 获得的膜岛细胞较小，数量较少，且花费较大等缺陷，提供一种高效的厮带间充质干细胞转 化为膜岛细胞的方法，通过该方法不仅提高了膜岛细胞的数量，也提高了膜岛细胞的质量。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是；提供一种厮带间充质干细胞转化为 膜岛细胞的方法，取第=代厮带间充质干细胞，置于培养箱中，按W下步骤对第=代厮带间 充质干细胞进行诱导：
[0007] 在细胞培养基中加入第一种诱导液，培养至细胞完成增殖过程，获得预转化干细 胞体；
[000引并在含有膜岛素-转铁蛋白-砸的DMEM/F12培养基中，加入第二种诱导液，培养 所述预转化干细胞体至细胞转化结束，获得膜岛细胞液；
[0009] 其中，所述第一种诱导液包括5-15mmol/L巧克酷胺、15-30yg/L表皮生长因子；
[0010] 所述第二种诱导液包括5-15mmol/L巧克酷胺和5-15yg/L碱性成纤维细胞生长 因子。
[0011] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第一诱导液还 包括60yg/l-150yg/L0 -神经生长因子和1-lOnmol/L激活素A。
[0012] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第一诱导液还 包括还原剂。
[0013] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述还原剂为 0 -琉基己醇，且0 -琉基己醇为5-15yg/L。
[0014] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第一种诱导液 中巧克酷胺的浓度为5mmol/l，表皮生长因子的浓度为30yg/l，0 -神经生长因子的浓度 为150yg/l，激活素A的浓度为lOnmol/l，0 -琉基己醇的浓度为10yg/L。
[0015] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第一种诱导液 中巧克酷胺的浓度为15mmol/l，表皮生长因子的浓度为15yg/l，0 -神经生长因子的浓度 为60yg/l，激活素A的浓度为lnmol/1，0 -琉基己醇的浓度为15yg/L。
[0016] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第一种诱导液 中巧克酷胺的浓度为lOmmol/l，表皮生长因子的浓度为25yg/l，0 -神经生长因子的浓度 为100yg/l，激活素A的浓度为4nmol/l，0 -琉基己醇的浓度为5yg/L。
[0017] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，DMEM/F12培养基中 含有的膜岛素-转铁蛋白-砸质量分数为1% -5%。
[0018] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第二种诱导液 中巧克酷胺的浓度为lOmmol/l，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10yg/L。
[0019] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第二种诱导液 中巧克酷胺的浓度为5mmol/l，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5yg/L。
[0020] 在本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法中，所述第二种诱导液 中巧克酷胺的浓度为15mmol/l，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15yg/L。
[0021] 实施本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法，可W达到W下有益 效果；该方法不仅易操作，而且所获得膜岛细胞数量较多，且膜岛细胞质量较好，能够分泌 较多的膜岛素。
【附图说明】
[0022] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0023] 图1为本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞方法所获得膜岛细胞通 过双硫腺染色得到的显微镜下的细胞分布图；
[0024] 图2为现有技术中厮带间充质干细胞和膜岛细胞共培养方式获得的膜岛细胞通 过双硫腺染色得到的显微镜下的细胞分布放大图。
【具体实施方式】
[0025] 为解决现有技术中利用厮带间充质干细胞与膜岛细胞共同培养诱导厮带间充质 干细胞转化的膜岛细胞较少，且数量较少等缺陷，本发明的创新点在于提供一种独立培养 诱导厮带间充质干细胞转化成膜岛细胞的方法，从而实现了提高厮带间充质干细胞转化率 及提高转化后膜岛细胞质量的目的。
[0026] 具体地，本发明提供的厮带间充质干细胞转化为膜岛细胞的方法为：
[0027] 取第=代厮带间充质干细胞，置于培养箱中，并按W下步骤对第=代厮带间充质 干细胞进行诱导：
[002引 1)在细胞培养基中加入第一种诱导液，培养至细胞完成增殖过程，获得预转化干 细胞体；
[0029] 2)并在含有质量分数为1% -5%的膜岛素-转铁蛋白-砸的DMEM/F12培养基中， 加入第二种诱导液，培养上述预转化干细胞体至细胞转化结束，获得膜岛细胞液.
[0030] 其中，所述第一种诱导液包括5-15mmol/L巧克酷胺和15-30 y g/L表皮生长因子；