一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的包埋共固定化方法
【专利说明】-种酵酬还原酶和葡萄糖脱氨酶的包埋共固定化方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶双酶的包埋共固定化方法。 (二）【背景技术】
[0002] 酶作为一种生物催化剂，因其专一性强、催化效率高和作用条件温和等特性，广泛 应用于医药、食品、化工等方面。但天然酶稳定性差，除了一些耐高温的酶及少数可W耐受 较低抑条件的酶W外，大多数酶在高温、强酸、强碱条件下都容易变性失活；反应结束后酶 与产物混合，不能重复利用，产物分离纯化困难；同时，酶的一次性使用，大大提高了生产成 本，不利于连续化生产，限制了酶在工业上更广泛的应用。基于上述情况，固定化酶的概念 得W提出，近年来，酶的固定化技术得到了不断发展，在综合不同固定化技术的基础上，又 出现了酶的共固定化技术，目前，酶的共固定化技术在临床诊断、发酵过程控制及生物传感 器制备等方面都发挥着重要作用。
[0003] 酶的固定化，是指采用物理或化学方法，将酶与水不溶性载体相结合的技术。固定 化之后酶既保持了其催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有稳定性增强，可反复或连 续使用及易于和产物分离的显著优点。酶的共固定化即将不同来源的几种酶或酶与某一完 整细胞同时固定在同一个载体上，不仅使不同酶及细胞的各自优势得到充分发挥，而且将 不同酶与细胞的生物催化性能结合起来。酶的固定化方法分为四类；吸附法，包埋法，结合 法W及交联法。
[0004] 醒酬还原酶作为一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，具有广泛的底物特异性，可将 脂肪族醒酬、芳香族醒酬、类固醇等很多幾基化合物还原成相应的醇类，在手性药物及药物 中间体合成领域发挥着重要作用。利用醒酬还原酶催化4-氯-3-幾基己酸己醋巧t的14-C hloro-3-oxobutanoate,CO邸）不对称还原合成的（R)-或（S)-4-氯-3-哲基了酸己醋巧t h}d4-chlo;r〇-3-hy化oxybutanoate,CHBE)，是多种药物活性成分如（R) -4-氯基-3-哲基了 酸己醋、L-肉毒碱、大环内醋A和（时-丫-氨基-0-哲基了酸佑AB0B)等合成的关键中间 体，具有重要的应用价值。
[0005] 在醒酬还原酶的催化反应中，都需要辅酶NAD(P)H的参与W提供反应持续进行所 需电子。因此，在反应体系中维持一定浓度的NAD(巧H，是保持反应连续进行的关键因素。 葡萄糖脱氨酶作为其辅酶再生系统可在将葡萄糖氧化为葡萄糖酸内醋的同时，将NADP+不 断转化为NADPH，通过其与醒酬还原酶的协同作用，共同完成CHBE的生物转化过程。采用醒 酬还原酶催化CHBE的合成具有高度的化学、区域和对映选择性，与化学工艺相比，具有明 显优势，如；避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，反应可在常温下进 行等，相对传统化学合成工艺催化剂来说，该酶催化的反应具有很强的绿色环保概念，具有 广阔的应用前景。 (H)
【发明内容】
[0006] 目前催化反应使用的酬还原酶多是游离酶或全细胞，虽操作简单，但催化过程中 所需辅因子NAD(P)H价格比较昂贵，且酶无法重复利用，生产成本偏高，限制了酶催化方法 的大规模工业化应用。
[0007] 本发明建立在本实验室已构建的来源多样化的各种醒酬还原酶酶库及多种重要 化工中间体酶催化生产工艺的基础上，在已有的醒酬还原酶生物催化研究中，为反应循环 提供NADK1的多为游离葡萄糖脱氨酶。为了克服游离酶稳定性差、不能重复利用等不足，本 发明提供了一种简单、快速的醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶双酶的包埋固定化方法，海藻酸 钢作为一种常用的多孔载体，将其与酶液混合后滴入到一定浓度的CaCl2溶液中，海藻酸钢 的Na+部分被化2+取代，形成凝胶小球颗粒，通过优化固定化条件最终获得性能改善的共固 定化酶。本发明首次将醒酬还原酶催化形成CHBE该一化工中间体生产工艺中的双酶进行 固定化，选用的醒酬还原酶为生物催化手性合成（R)-CHBEe.e.值达99%W上的优质酶， 通过将醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶共固定在海藻酸钢载体上制备的共固定化酶，不仅可重 复使用，降低酶制剂生产成本，也可为所构建酶库中其它酶的成本降低提供借鉴和示范。 [000引本发明所采用的技术方案是；
[0009] 本发明提供一种醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶的包埋共固定化方法，所述方法包 括；将醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶混合后加入海藻酸钢水溶液中，揽拌混匀后，揽拌下再将 混合液滴加入化C12水溶液中，4 °C冰箱内静置，蒸馈水洗漆，真空抽滤，获得固定化颗粒；所 述醒酬还原酶与葡萄糖脱氨酶质量比为1:0. 5~3. 5,所述海藻酸钢水溶液中海藻酸钢与 醒酬还原酶质量比为30~170 ;1。
[0010] 进一步，所述海藻酸钢水溶液是将海藻酸钢加入沸水中溶解，冷却后加入酶，或者 将海藻酸钢加入水中，置于磁力揽拌器上，4°c恒温层析柜中过夜溶解。
[0011] 进一步，海藻酸钢水溶液的质量浓度为1~5%。
[0012] 进一步，CaCls水溶液质量浓度为0. 5~4%，CaCl2水溶液体积用量与醒酬还原酶 质量计通常为50-100ml/mg。
[0013] 进一步，优选所述4°C冰箱内静置1-化，蒸馈水洗漆2-3次。
[0014] 进一步，所述醒酬还原酶是W醒酬还原酶酶液的形式加入，所述醒酬还原酶酶液 是指将含醒酬还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎 混合液经镶柱分离后的酶液；所述醒酬还原酶基因的核巧酸序列为SEQIDNO. 1所示。
[0015] 进一步，所述葡萄糖脱氨酶是W葡萄糖脱氨酶酶液的形式加入，所述葡萄糖脱氨 酶酶液是指将含葡萄糖脱氨酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声 破碎，破碎混合液经镶柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氨酶基因的核巧酸序列为SEQID NO. 2所示。
[0016] 进一步，所述醒酬还原酶按如下方法制得：将含SEQIDNO. 1所示醒酬还原酶基 因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37°C过夜培养，获得菌液；按体积浓度1% 接种量将菌液转接于含100yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm振荡培养至 0D600达0. 6,加入终浓度0.ImM的IPTG，25°C、150巧111诱导表达12~16h，4°C、8000巧m离 屯、15min收集菌体，超声破碎，离屯、收集上清并用镶柱对其进行纯化，得到醒酬还原酶的酶 液。具体菌体破碎纯化的方法为；将菌体用抑7. 4的PBS溶液洗漆后重悬于50mL的相同缓 冲液中，将重悬混合液置于冰水混合物中，利用超声破碎仪进行破壁（工作3s，间隔3s，工 作时间45min)，破碎结束后，4°C、12000巧m离屯、30min，收集上清并用镶柱对其进行纯化， 最终得到醒酬还原酶纯酶液。
[0017]本发明所述含SEQIDNO. 1所示醒酬还原酶基因的重组基因工程菌构建方法为： 将SEQIDNO. 1所示核巧酸序列与载体祀T28a连接，连接产物转化E.coliD册a感受态 细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到祀T28a-Lek质粒。然后 将重组质粒导入E.coli化2UDE3)，获得重组菌祀T28a-Lek-E.coliBL2UDE3)。
[001引进一步，所述葡萄糖脱氨酶按如下方法制得；将含SEQIDNO. 2所示葡萄糖脱氨酶 基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37°C过夜培养，获得菌液；按体积浓度1 % 接种量将菌液转接于含100yg/mL氨节霉素的LB液体培养基中，37°C培养至0D600达0. 6， 向培养液中加入终浓度0.ImM的IPTG，25°C、150巧m诱导表达12~16h，离屯、收集菌体，超 声破碎，离屯、收集上清并用镶柱进行纯化，得到葡萄糖脱氨酶的酶液。具体，所述菌体纯化 的方法为；将菌体用抑8. 0的PBS溶液洗漆后重悬于50mL的相同缓冲液中，重悬混合液置 于冰水混合物中超声破碎（工作3s，间隔3s，工作时间45min)，破碎结束后，4°C、12000巧m 离屯、30min，收集上清并用镶柱进行纯化，最终得到葡萄糖脱氨酶纯酶液。
[0019] 本发明所述含SEQIDNO. 2所示葡萄糖脱氨酶基因的重组基因工程菌构建方法 为：将SEQIDNO. 2