一种采用茶氨酸合成酶的茶氨酸制备工艺的制作方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及茶氨酸制备的技术领域，特别是利用生物酶制备茶氨酸的技术领域。【【背景技术】】
[0002]茶氨酸是茶叶中特有的氨基酸，占氨基酸的50%，其结构式为:CH3CH2NHCOCH2CH2CH(NH2)COOH,它是茶叶中最丰要的呈味物质。茶氨酸是一种安全、无毒、具有多种生理功能的天然食品添加剂。在国外已在食品如饮料、焙烤点心、冷冻点心等中得到广泛的应用，在国内茶氨酸在食品领域的应用还是空白。日本已于1964年批准L-茶氨酸为食品添加剂，美国FDA于1985年将L-茶氨酸确认为公认安全物质。最近的动物和人体试验表明(凌关庭，L.茶氨酸及其生理功能，粮食与油脂。2003.5，46-49):L_茶氨酸是一种安全，有效，无任何副作用的兴奋促进剂，是咖啡因的优良替代品。L-茶氨酸提神，使思维敏捷，集中注意力，提高学习能力、降低血压、减少肌肉张力疼痛、解消疲劳、调节心情、松驰精神的功效。无咖啡因的紧张和恶心等副作用。利用茶氨酸的特殊生理功能，开发出功能性保健药物，这将对解决人们的亚健康状态起到一定的作用。
[0003]目前L-茶氨酸的合成方法主要包括氯甲酸苄酯保护氨基(酒户弥二明，L一茶氨酸的合成【J】日本农业化学会志1950，23:269)、吡咯烷酮酸法(CN02134857)、邻苯二甲酸酐法(CN200410014081)等保护氨基的方法合成。这些合成方法不同程度地存在生产成本高、反应速度慢、选择性差、收率低、副产物含量高等缺点。
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【发明内容】
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[0004]本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种采用茶氨酸合成酶的茶氨酸制备工艺，能够通过茶树体内的茶氨酸合成酶在茶树体外合成茶氨酸，具有反应速度块、选择性好、收率高、副产品含量低的优点，并且生产成本较低。
[0005]为实现上述目的，本发明提出了一种采用茶氨酸合成酶的茶氨酸制备工艺，包括以下步骤:
[0006]a)材料准备:取适量培养好的茶苗、发芽茶苗的根和茶树的鲜叶，洗净沥干后于-25?_30°C条件下保存3?5小时，然后将养好的茶苗、发芽茶苗的根和茶树的鲜叶至于打匀机中；
[0007]b)茶氨酸合成酶粗酶液制取:向打匀机中先加入60?70%的PVP凝胶和PVPP，然后加入适量pH为7?8的柠檬酸盐缓冲液，再加入适量0.02?0.03mol/L的MgCl2、0.02?0.03mol/L KCl2溶液和0.06?0.07mol/L的2-巯基乙醇，同时加入适量预冷丙酮，进行匀浆后抽滤得到丙酮粉，用预冷的柠檬酸盐缓冲液溶解丙酮粉，将溶液进行离心，取上清溶液即为茶氨酸合成酶粗酶液；
[0008]c)茶氨酸合成酶的初步纯化:向茶氨酸合成酶粗酶液中缓慢加入适量氯化铵粉末，将溶液在磁力搅拌器上缓慢搅拌，使溶液达到80%饱和度后继续搅拌30?40min，让后将溶液放置于O?-10°C条件下冷藏12?24h，再将溶液进行离心处理，收集沉淀，将沉淀溶解于预冷的柠檬酸盐缓冲液中，再重复上述步骤2?3次；
[0009]d)茶氨酸合成酶的进一步纯化:将步骤c中的得到的溶液先进行离子交换层析处理，再经过凝胶过滤层析处理；
[0010]e)茶氨酸合成酶的固定:将经过纯化的茶氨酸合成酶固定在有机载体或者无机载体上，然后添加适量戊二醛使得茶氨酸合成酶和载体形成交联；
[0011]f)茶氨酸的制备:将基质溶液以一定的流速通过固定有茶氨酸合成酶的有机载体或者无机载体，能得到一定收率的茶氨酸，所述Iml基质溶液中含有25?30 μ mo I的谷氨酸，10?20 μ mo I的乙胺，5?10 μ mo I的2_疏基乙醇，25?35 μ mo I的MgCl2, 25?30 μ mo I 的 KC12，25 ?30 μπιο? 的 NaCl2,10 ?20 μπιο? 的 Tris-HCl，10 ?20 μπιο? 的葡萄糖溶液。
[0012]作为优选，所述柠檬酸盐缓冲液采用柠檬酸钾缓冲液或者柠檬酸钠缓冲液，有利于保持茶氨酸和合成酶的体外活性。
[0013]作为优选，所述预冷丙酮的温度为O?-10°C，能较长时间的保持茶氨酸合成酶在茶树体外的活性。
[0014]作为优选，所述凝胶过滤层析采用SephadexG-25凝胶进行过滤层析，能进一步纯化茶氨酸合成酶。
[0015]作为优选，所述有机载体采用陶瓷粉或者聚丙烯或者疏水吸附树脂，所述无机载体采用分子筛或者多孔玻璃或者活性炭，将茶氨酸合成酶固定后，提高了茶氨酸合成酶与基质溶液的接触面积，提高了茶氨酸的收率。
[0016]本发明的有益效果:本发明从茶树体内提取茶氨酸合成酶时，加入PVP凝胶和PVPP来吸附茶多酚，防止茶多酚破坏茶氨酸合成酶的结构，并采用严格的低温丙酮处理，使得茶氨酸合成酶可逆而不失活的沉淀下来，从而获得活性高的茶氨酸合成酶，通过高活性的茶氨酸合成酶来制备茶氨酸，具有反应速度块、选择性好、收率高、副产品含量低的优点，并且生产成本较低。
【【具体实施方式】】
[0017]实施例一:
[0018]取1g培养好的茶苗、发芽茶苗的根和茶树的鲜叶，洗净沥干后于-25°C条件下保存3小时，然后将养好的茶苗、发芽茶苗的根和茶树的鲜叶至于打匀机中；向打匀机中先加入60 %的PVP凝胶和PVPP，然后加入适量pH为7?8的柠檬酸盐缓冲液，再加入适量0.02mol/L的MgCl2、0.02mol/L KCl2溶液和0.06mol/L的2-巯基乙醇，同时加入适量预冷丙酮，进行匀浆后抽滤得到丙酮粉，用预冷的柠檬酸盐缓冲液溶解丙酮粉，将溶液进行离心，取上清溶液即为茶氨酸合成酶粗酶液；向茶氨酸合成酶粗酶液中缓慢加入适量氯化铵粉末，将溶液在磁力搅拌器上缓慢搅拌，使溶液达到80%饱和度后继续搅拌30min，让后将溶液放置于0°C条件下冷藏12h，再将溶液进行离心处理，收集沉淀，将沉淀溶解于预冷的柠檬酸盐缓冲液中，再重复上述步骤2?3次；将步骤c中的得到的溶液先进行离子交换层析处理，再经过凝胶过滤层析处理；将经过纯化的茶氨酸合成酶固定在有机载体或者无机载体上，然后添加适量戊二醛使得茶氨酸合成酶和载体形成交联；将基质溶液以一定的流速通过固定有茶氨酸合成酶的有机载体或者无机载体，能得到一定收率的茶氨酸，所述Iml基质溶液中含有25 μ mol的谷氨酸，1ymol的乙胺，δμπιο?的2-巯基乙醇，25 μ mol的MgCl2, 25 μ mo I 的 KCl2, 25 μ mo I 的 NaCl2,10 μ mo I 的 Tris-HCl, 10 μ mo I 的葡萄糖溶液；所述柠檬酸盐缓冲液采用柠檬酸钾缓冲液或者柠檬酸钠缓冲液，所述预冷丙酮的温度为0°c所述凝胶过滤层析采用SephadexG-25凝胶进行过滤层析，所述载体采用有机载体，所述有机载体采用聚丙烯。
[0019]实施例二:
[0020]取15g培养好的茶苗、发芽茶苗的根和茶树的鲜叶，洗净沥干后于-30°C条件下保存4小时，然后将养好的茶苗、发芽茶苗的