检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒及寡核苷酸的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测大丽花潜隐类病毒的实时巧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测 试剂盒及寡核巧酸，属于检验检疫领域。
【背景技术】
[0002]大丽花潜隐类病毒值址lia latent viroid，DLVd)，该一新类病毒的RNA分子 大小为34化t，与其他已知病毒的序列相似性低于56%。其基因组能够折叠成椿状的二 级结构，且能够形成亚稳定的发夹结构I和IlOlairpinl，II) W及啤酒花矮化类病毒属 化ostuviroid)的CCR结构域，但与啤酒花矮化类病毒化op S化nt viroid，HSVd)不同， DLVd并没有末端保守的发夹结构（terminal conserved hai巧in,TCH)，而是含有马铃馨纺 键块茎类病毒属（Pospiviroid)的末端保守区（terminal conserved region，TCR)。该表 明DLVd可能是由Hostuviroid和化spiviroid重组形成的新种。虽然DLVd与化spiviroid 的辣椒小果类病毒（P巧per chat化uit viroid，PCFVd)的亲缘关系最接近，但是它们的寄 主范围截然不同。DLVd的寄主范围相对较窄，到目前为止，发现其只侵染大丽花。因此，其 分类地位有待进一步的研究。
[000引 目前，国内外已报道检测植物病毒的方法有指示植物法、分子杂交、ELISA、RT-PCR 和基因巧片技术等，该些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，有的易于造成交 叉污染，出现假阳性结果。RT-qPCR技术是在常规PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量 技术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性巧光探针（TaqMan探针），探针 与模板特异性结合，其结合位点位于引物对之间，利用巧光信号累积实时监测整个PCR过 程。该技术可W采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测，其中绝对定量是目前采 用最多的一种，但是需要采用外标准品的定量制备来实现。在RT-qPCR定量检测中，该些外 标准品的制备成为其能否准确定量的关键。RT-qPCR整个过程在全封闭的状态下进行扩增 及产物分析，有效地减少污染及对人体的危害。该技术具有特异性强、灵敏度高、自动化程 度高、检测简单快速、技术易于掌握等特点，是快速分子诊断的发展趋势。
[0004] 目前RT-qPCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检 巧。、线虫检测等诸多领域，但对大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测尚未见公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的检测大丽花潜 隐类病毒的寡核巧酸，包括引物和探针。
[0006] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测大丽花潜隐 类病毒的RT-qPCR检测试剂盒。
[0007] 本发明要解决的第S个技术问题是提供一种检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR 检测方法。
[000引为解决第一个技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0009] -组检测大丽花潜隐类病毒的寡核巧酸，为序列表SEQIDNo.1至SEQIDNo. 3 所示的寡核巧酸，其中序列SEQIDNo.1和SEQIDNo. 2分别为检测大丽花潜隐类病毒的 正义引物和反义引物，序列SEQIDNo. 3为检测大丽花潜隐类病毒的巧光探针，
[0010] 具体为：
[0011]引物DLVd-FP;5'-CCGCTCCTTGTAGCTTTGAGA-3'，（SEQIDNo. 1);
[0012]引物DLVd-RP;5'-GGTCGCGTCCTCGAGTCA-3'，（SEQIDNo. 2);
[0013]探针DLVd-P ;5' -TACCGCCCTTTTGCTTCCTTCTCGC-3'，（SEQIDNo.3);探针的5'端 标记报告巧光基团FAM，3'端标记泽灭巧光基团B册1。上述引物和探针扩增的目标片段长 度为69bp。
[0014] 为解决第二个技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0015] 本发明提供了一种检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒，其包括用于检 测大丽花潜隐类病毒的引物和探针。具体地，引物和探针如序列表SEQIDNo. 1至SEQID No. 3所示，其中序列SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2分别为检测大丽花潜隐类病毒的正义引 物和反义引物，序列SEQIDNo. 3为检测大丽花潜隐类病毒的巧光探针，该探针的5'端标 记报告巧光基团FAM，3'端标记泽灭巧光基团B册1。上述引物和探针可W分装，也可W预先 混合在一起。
[0016] 所述检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒还包括阴性对照和阳性对照。 其中，所述阴性对照；采用无大丽花潜隐类病毒感染大丽花叶片，液氮研磨后，加入DEPC水 充分研磨，然后5000rpm离屯、3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水；所述阳性对照：采用 感染大丽花潜隐类病毒感染大丽花叶片，液氮研磨后，加入DEPC水充分研磨，然后5000巧m 离屯、3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水。
[0017] 进一步地，上述检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测试剂盒还可W包括完成 RT-qPCR反应所需的试剂和酶，优选地，其包括；10XPCR缓冲液（含Mg")，dNTP混合物，反 转录酶，RNA酶抑制剂，TaqDNA聚合酶和DEPC水，均购自TaKaRa公司。
[0018] 为解决第S个技术问题，本发明还提供了检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测 方法，包括如下步骤：
[001引 （1)提取样品RNA;
[0020] 取携带大丽花潜隐类病毒的大丽花叶片，经RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司） 提取植物总RNA，也可W使用现有技术中已知的提取RNA的方法进行提取；
[0021] (2)对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增；
[0022] 表1RT-qPCR反应体系
[0023]
[0024] 反应条件；
[00巧]45°C 15min ;95°C 5min ;然后95°C 5s，60°C 30s，共40个循环。
[002引 做结果判定：
[0027] 结果分析条件设定；阔值设定原则W阔值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最 高点。Ct值《35,而且出现明显的扩增曲线为阳性，表明样品中存在DLVd;无Ct值，并且无 扩增曲线为阴性，表明样品中无DLVd。
[0028] 本发明针对当前无大丽花潜隐类病毒检测有效方法，提供了一种操作简单、快速、 灵敏、准确的检测大丽花潜隐类病毒的RT-qPCR检测方法，可达到准确定量待测样品中 DLVd的目的。
[0029] 本发明的有益效果；
[0030] 1、本发明所提供的引物和探针可用于大丽花潜隐类病毒的定性及定量分析，对判 断DLVd在植物体内复制规律、复制水平和用药后DLVd是否被清除等方面的研究具有重要 意义；
[0031] 2、本发明将在大丽花潜隐类病毒的大规模检疫、流行病学调查及早期诊断方面发 挥重要作用。
【附图说明】
[0032]图1为大丽花潜隐类病毒引物和探针特异性扩增曲线。
[0033] 图2为6份待测样品的RT-qPCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但该些实施例仅限于说明本发明而不 用于