生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物素改变体、链霉亲和素突变体和它们的用途。更详细地，本发明设 及降低了与天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体、与上述链霉亲和素突变体具有亲和 性的生物素改变体、W及它们的用途。
【背景技术】
[0002] 亲和素与生物素、或链霉亲和素与生物素之间的亲和性非常高（制=1045至 1〇 441)，作为生物体二分子间的相互作用，是最强的相互作用之一。现在，亲和素/链霉亲和 素-生物素相互作用被广泛应用于生物化学、分子生物学或医学的领域（Green, (1975)， Adv.ProteinQiem., 29: 85-133;Green, (1990),MethodsEnzymol., 184: 51-67)。 亲和素是来源于蛋清的碱性糖蛋白，等电点超过10。另一方面，链霉亲和素来源于放线菌 (Str巧tomycesavidinii)，等电点在中性附近，且不含糖链。两种蛋白质均形成4聚体，每 1个亚基与1分子的生物素结合。分子量为60kDa左右。
[0003] 近年来，设计出组合了该亲和素/链霉亲和素与生物素的高结合能力和抗体分子 的药物递送方法、预祀向方法（化atowich, (1987)，J.Nucl.Med.，28，1294-1302)。然 而，来源于鸡的亲和素或来源于微生物的链霉亲和素对人体显示出高免疫原性，因而在给 予人体后，早期产生抗亲和素/链霉亲和素抗体成为问题，从而成为阻碍预祀向方法实用 化的原因之一（Paganelli, (1991),CancerRes. , 51, 5960-5966)。报道了用于解决上 述问题的低免疫原性链霉亲和素（国际公开W02010/095455)。
[0004] 现有技术文献 专利文献 专利文献1 ;国际公开W02010/095455 非专利文献 非专利文献l;Green, (1975),Adv.ProteinQiem., 29: 85-133; 非专利文献 2 ;Green, (1990)，MethodsEnzymol.，184: 51-67 非专利文献 3 ;Hnatowich, (1987)，J.Nucl.Med.，28，1294-1302 非专利文献 4 ;Paganelli, (1991)，CancerRes., 51，5960-5966)。
【发明内容】
[0005] 发明要解决的问题 如上所述的低免疫原性链霉亲和素具有对人体的免疫原性降低了的特征，但由于对存 在于人体内部的生物素具有亲和性，因而下述问题令人担忧；在诊断用途的情形中，存在背 景变高的问题，在治疗用途的情形中，存在不能对疾病特异性地发挥药效的可能性。因此， 本发明的课题是要解决下述问题；提供降低了对天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变 体、进而提供对与该天然生物素的亲和性低的链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改 变体。进而，本发明的课题是要解决下述问题：提供组合使用了上述链霉亲和素突变体与生 物素改变体的诊断药物?治疗药物、组合使用了上述链霉亲和素突变体和生物素改变体的 诊断试剂盒?治疗试剂盒。
[0006] 用于解决问题的方法 本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，通过对国际公开W02010/095455中记 载的低免疫原性链霉亲和素突变体进一步导入规定的的氨基酸突变，成功获得了降低了对 天然生物素的亲和性的链霉亲和素突变体。同时，通过改变生物素的结构的一部分，合成了 各种生物素改变体。继而，调查了上述链霉亲和素突变体和上述生物素改变体的亲和性，结 果发现了相互具有亲和性的组合，从而完成了本申请发明。
[0007] 良P，根据本发明，提供W下发明。
[0008] [1]下述式（1)所示的化合物，
[化1]
式中，XI和X2各自独立地表示0或NH，Y表示C或S，Z表示0、S或NH，V表示S或S+ -〇-，n表示0或1的整数，m表示1至10的整数，W表示-0H、-NH(邸2)pCOOH、或-NH (邸2)qC(畑2)C00H;其中，P和q各自独立地表示1至10的整数。
[0009] 巧][1]所述的化合物，其是n为0的下述式（2)所示的化合物，
[化2]
式中，《1、《2、￥、2、￥、111、和1与[1]中含义相同。
[0010] [3]W下的任一化合物，
[化3]
[0011] [4]链霉亲和素突变体，其含有SEQIDNo: 3至12中任一者所记载的氨基酸序列。
[001引[引编码[4]所述的链霉亲和素突变体的DNA。
[0013] [6]链霉亲和素突变体-分子探针结合物，其是通过使分子探针与[4]所述的链霉 亲和素突变体结合而得的。
[0014] [7]治疗剂或体内或体外诊断剂，其含有[6]所述的链霉亲和素突变体-分子探针 结合物。
[0015] [引治疗或体内或体外诊断试剂盒，其含有；（a) [6]所述的链霉亲和素突变体一 分子探针结合物；和（b)经[1]至巧]中任一项所述的化合物标记的体内或体外诊断用或 治疗用物质。
[0016] [9]用于治疗或体内或体外诊断的试剂盒，其含有： (a) 降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性的链霉亲和素突变体、和 (b) 对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体。
[0017] [10]治疗或体内或体外诊断试剂盒，其含有： (a) 降低了与天然生物素或生物胞素的亲和性的链霉亲和素突变体与分子探针的结合 物、和 (b) 经对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体标记的体内或体外诊断 用或治疗用物质。
[001引发明效果 根据本发明，提供免疫原性降低的同时对天然生物素的亲和性也降低了的链霉亲和素 突变体、与对上述链霉亲和素突变体具有高亲和性的生物素改变体的组合。本发明的链霉 亲和素突变体与生物素改变体的组合在基于预祀向方法的诊断方法?治疗方法中有用。
【附图说明】
[0019] 图1示出链霉亲和素突变体重组蛋白的粗纯化的结果。
[0020] 图2示出与生物素-HRP标记体的竞争分析的结果。
[0021] 图 3 示出坐滴蒸气扩散法（Sitting化opvapordiffusionmethod)。
[0022] 图4示出LISA314和LISA314-V21的结晶结构。
[0023] 图5示出LISA314和LISA314-V21的结晶结构。 (A)LISA314与生物素的共晶结构。（B)LISA314-V21与亚氨基生物素长尾(iminobiotinlongtail)的共晶结构。将亚基A和C用线条带表示，B和D用扁平带表 /J、- 〇
[0024] 图6示出重折叠蛋白的纯化的一例。
[002引图7示出对生物胞素与LISA314WT的相互作用进行SPR分析时的传感图。
[0026] 图8示出对生物胞素与LISA314V21的相互作用进行SPR分析时的传感图。
[0027] 图9示出对化合物29与LISA314V21的相互作用进行SPR分析时的传感图。
【具体实施方式】
[002引 W下，对本发明进行更详细说明。
[0029] (1)生物素改变体 本发明的生物素改变体是下述式（1)所示的化合物，优选是式（1)中n为0时的式（2 ) 所示的化合物。
[0030][化句
式中，XI和X2各自独立地表示0或NH，Y表示C或S，Z表示0、S或NH，V表示S或S+ -0-，n表示0或1的整数，m表示1至10的整数，W表示-0H、-NH(邸2)pCOOH、或-NH (邸2)qC(畑2)COOH;其中，p和q各自独立地表示1至10的整数。
[0031] 式（1)和式（2)中，下述结构；
[化6]
中的任一者，但并不限定于此。
[0032]m表示1至10的整数，优选表示2至10的整数，更优选表示2至8的整数，更优选 表示2至6的整数，特别优选表示4。
[0033] P和q各自独立地表示1至10的整数，优选表示2至10的整数，更优选表示2至 8的整数，更优选表示2至6的整数，特别优选表示4或5。
[0034] 本发明的式（1)或式（2)的化合物可W通过W下的实施例1中记载的合成方法来 合成。实施例1中的化合物11、19、21、23、24、27、29、31、36、37、46和47是本发明的式（1) 或式（2)的化合物。
[00巧] 化合物11的合成方法 首先，在（L)-阿拉伯糖(化合物1)的DMF溶液中加入2, 2-二甲氧基丙烷和甲苯横酸 一水合物，由此得到（3aS，7R，7aR)-2, 2-二甲基四氨-3aH-[l，3]二氧杂环戊締并[4,5-C] 化喃-6, 7-二醇（化合物2)。将化合物2溶解于水和己烧的混合溶剂中，加入高舰酸钢 并进行揽拌，加入碳酸钢，由此得到（335,635)-2,2-二甲基四氨快喃并巧，4-(1][1，3]二 氧杂环戊締-4-醇（化合物3)。在化合物3的DMF溶液中加入娃藻±(Celite)和重铭 酸化晚鐵进行反应，由此得到（3aS，6aS)-2,2-二甲基二氨快喃并巧，4-d][l，3]二氧杂 环戊締-4(3aH)-酬（化合物4)。在化合物4的DMF溶液中加入硫代己酸钟进行反应， 由此得到（3aS，6aR)-2,2-二甲基二氨唾吩并巧，4-d][l，3]二氧杂环戊締-4(3aH)-酬 (化合物5)。在化合物5的THF溶液中加入3-了締-1-基漠化儀进行反应，由此得到 (3aS，6aR)-4-(3-了締-1-基）-2, 2-二甲基四氨唾吩并巧，4-d] [1，3]二氧杂环戊締-4-醇 (化合物6)。在化合物6的CH2CI2溶液中加入S己基硅烷并进行揽拌后，加入S氣己 酸化75 9.05臟〇1)进行反应，由此得到（25,35,4时-2-(3-了締-1-基）四氨唾 吩-3, 4-二醇（化合物7)。在化合物7的CH2CI2溶液中加入化晚和S光气进行反应，由此 得到（3aS，4S，6aR)-4-(3-了締-1-基）四氨唾吩并巧，4-d][l，3]二氧杂环戊締-2-酬 (化合物8)。在含有化合物8的CH2CI2溶液中加入丙締酸节醋和第二代化veyda-Grubbs 催化剂，进行加热回流，由此得到巧)-苄基5-((3aS，4S，6aR)-2-氧代四氨唾吩并巧，4-d] [1，3]二氧杂环戊締-4-基）-2-戊締酸醋（化合物9)。在化合物9的己醇溶液中加入钮 碳，在氨气存在下揽拌，进行反应，由此得到5- ((3aS，4S，6aR) -2-氧代四氨唾吩并巧，4-d] [1，3]二氧杂环戊締-4-基）戊酸节醋（化合物10)。在含有化合物10的CH2CI2溶液中加 入S漠化棚进行反应，由此得到本发明的式（1)所示的（(3aS，4S，6aR)-2-氧代四氨唾吩并 巧，4-d][l，3]二氧杂环戊締-4-基）戊酸（化合物11)。
[0036]化合物19的合成方法 在化合物13的无水THF溶液中滴加正了基裡溶液（2. 6M己烧溶液）并进行揽拌后， 滴加化合物12与HMPA无水THF溶液并进行揽拌，由此得到（时-叔了基4-((时-1-哲 基-6-(4-甲基-2, 6, 7-二氧杂双环[2. 2. 2]辛烧-1-基）-2-己诀基-1-基}d)-2, 2-二 甲基唾挫烧-3-甲酸醋（化合物14)。在含有化合物14的无水甲苯溶液中加入六甲基二 娃氮烧裡溶液进行反应，由此得到（1R，7aR)-5, 5-二甲基-1-(5-(4-甲基-2, 6, 7-S氧杂 双环化2. 2]辛烧-1-基）-1-戊诀-1-基）二氨-1H-唾挫并化4-C]曠挫-3巧H)-酬 (化合物15)。在化合物15的C&CN和&0混合溶液中，加入硝酸银（I)进行反应，由此得 到巧)-3-哲基-2-(哲基甲基）-2-甲基丙基5-((3aR，6a巧-2-氧代四氨唾吩并巧，4-d] 曠挫-6化aH)-亚基）戊酸醋（化合物16)。在化合物16和己酸締丙醋的甲醇溶液中加 入氨氧化钮碳，在氨气存在下进行反应，由此得到3-哲基-2-(哲基甲基）-2-甲基丙基 5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代六氨唾吩并巧，4-d]曠挫-6-基）戊酸醋（化合物18)。在化合物 18的C&CN和&0的混合溶液中，加入氨氧化裡进行反应，由此得到5- ((3aR，6S，6aS) -2-氧 杂六氨唾吩并巧，4-d]曠挫-6-基）戊酸（化合物19)。
[OOW]化合物21的合成方法 在室温下在生物素（化合物20)的己酸溶液中加入NaB化? 4&0,揽拌后加入硫代硫酸 钢，减压下蒸馈除去溶剂，由此得到5- ((3aS，4S，6aR) -5-氧化物-2-氧代六氨-1H-唾吩并 [3, 4-d]咪挫-4-基）戊酸（化合物21)。
[0038]化合物23的合成方法 在亚氨基生物素（化合物22)的1，1，1，3, 3, 3-六氣异丙醇溶液中加入&化水溶液 进行反应，由此得到5-((3aS，4S，6aR)-2-亚氨基-5-氧化物六氨-1H-唾吩并巧，4-d]咪 挫-4-基）戊酸（化合物23)。
[0039]化合物24的合成方法 在化合物11的1，1，1，3, 3, 3-六氣异丙醇溶液中加入&化水溶液进行反应，由此得到 5-((335,45,63时-5-氧化物-2-氧代四氨唾吩并巧，4-(1][1，3]二氧杂环戊締-4-基）戊 酸（化合物24)。
[0040]化合物27的合成方法 在生物素甲基醋（化合物25)的甲苯溶液中加入Lawesson's试剂进行反应， 由此得到5- ((3aS，4S，6aR) -2-硫代六氨-1H-唾吩并化4-d]咪挫-4-基）戊酸甲 醋（化合物26)。在含有化合物26的THF溶液中添加氨氧化钢水溶液，由此得到 5- ((3aS，4S，6aR) -2-硫代六氨-IH-唾吩并巧，4-d]咪挫-4-基）戊酸（化合物27)。
[0041]化合物29的合成方法 在6-氨基己酸的二曠烧和&0的混合溶液中，加入氨氧化钢水溶液，调整至pH为9左 右。加入化合物28进行反应，由此得到5-((3aR，6S，6aS)-2-氧代六氨唾吩并巧，4-d]曠 挫-6-基）戊酸（化合物29)。
[0042]化合物31的合成方法 对化合物28和Na-BocA-赖氨酸的