新颖的胰岛素类似物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明W增加膜岛素在血液中的半衰期为目的，设及一种不仅膜岛素效价低于天 然膜岛素且对膜岛素受体的结合力减少的膜岛素类似物、所述膜岛素类似物与载体连接而 成的复合物、包含所述复合物的长效制剂、及制造所述复合物的方法。
【背景技术】
[0002] 众所周知，生物体内的蛋白质是通过被血液中的蛋白质分解酶分解、或通过肾脏 排泄或由受体清除等多种途径来清除。对此，不断进行规避如上所述的蛋白质清除机理而 增加生物活性蛋白质的半衰期，提高治疗功效的多种尝试。
[0003] 另一方面，膜岛素作为从人体的膜腺分泌的血糖调节激素，发挥向细胞移送血液 内多余的葡萄糖来对细胞供给能源，并且使血糖保持正常水准的作用。但对于糖尿病患者 而言，因该种膜岛素不足或膜岛素抵抗性及0细胞丧失功能而膜岛素无法发挥正常的功 能，从而无法将血液内的葡萄糖用作能源，血液中的葡萄糖水准呈现出较高的高血糖症状， 最终通过小便排出糖，并伴随着多种并发症。因此，对于膜岛素的生成存在异常（I型）或 因膜岛素的耐性引起的（II型）糖尿病患者而言，膜岛素治疗是必不可少的，当投用膜岛素 时，可将血糖调节在正常水准。然而，膜岛素与其他蛋白质及肤激素同样地存在因体内的 半衰期极短而需持续地反复投用的缺点。该种频繁的投用会给患者带来非常大的痛苦和不 便。因此，为了通过增加蛋白质在生物体内的半衰期来减少投用次数而提高患者的生活质 量，不断进行多种蛋白质的剂型化研究和对化学复合物等（脂肪酸复合物、聚己締聚合物 复合物）的研究。作为目前市售的长效膜岛素，有赛诺菲-安万特公司（Sanofi-Aventis) 的甘精膜岛素（insulinglargine，Ian化S，药效持续时间为约20~22小时）、诺和诺德公 司（NovoNordisk)的地特膜岛素（insulindetemir，levemi;r，药效持续时间为约18~22 小时）、及tres化a(德谷（degludec)，药效持续时间为约40小时）。该些长效膜岛素因在 血液中没有膜岛素浓度峰值而适合用作基础膜岛素，但它们的半衰期也不够长，因而仍存 在每天需投用一次或两次的不便，该对于需要长期投用的糖尿病患者而言，在实现通过大 幅减少投用频率而提高患者的便利性的目的方面有限。
[0004] 根据现有的研究结果报告，已知体内膜岛素的清除过程具体如下；50%W上的膜 岛素通过肾脏清除，剩余的膜岛素通过受体介导清除（rec巧tormediatedclearance， RMC)步骤从肌肉、脂肪、肝脏等祀标部位（targetsite)清除。
[0005]与此相关，在JF*ha;rmacolExp"Ther(1998) 286:959、Diabetes Care(1990) 13:923、Di油etes(1990) 39:1033等多个报告中指出，为了规避膜岛素的RMC， 可通过削弱in-vitro活性而增加血液中的浓度，但对于该些对受体的结合力减少的膜岛 素类似物而言，即使减少RMC，也无法规避主要清除机制即从肾脏的清除，因而在大幅增加 血液中的半衰期方面有限。
【发明内容】
[0006][发明要解决的问题]
[0007] 本发明人等为了增加膜岛素在血液中的半衰期而进行了锐意研究，结果确认到按 照非天然膜岛素序列而并非天然膜岛素序列新颖地制造的膜岛素类似物不仅in-vitro效 价减少，而且因与膜岛素受体的结合力减少而从肾脏的清除减少，并且确认到通过在所述 膜岛素类似物结合可有效增加半衰期的代表性的载体即免疫球蛋白化片段而膜岛素在血 液中的半衰期进一步增加，由此完成了本发明。
[000引[解决问题的技术手段]
[0009] 本发明的目的在于，W延长膜岛素在体内的半衰期为目的，制造in-vitro效价减 少的膜岛素类似物，并提供一种其与载体形成的复合物。
[0010] 具体而言，本发明的一目的在于提供一种膜岛素效价低于天然膜岛素的膜岛素类 似物。
[0011] 本发明的又一目的在于提供一种膜岛素类似物与载体结合而成的膜岛素类似物 复合物。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种包含所述膜岛素类似物复合物的膜岛素长效制 剂。
[0013] 本发明的又一目的在于提供一种制造所述膜岛素类似物复合物的方法。
[0014] 本发明的又一目的在于提供一种利用所述膜岛素类似物、或膜岛素类似物与载体 结合而成的膜岛素类似物复合物来增加在生物体内的半衰期的方法。
[0015] 本发明的又一目的在于提供一种治疗与膜岛素相关的疾病的方法，所述方法包含 将所述膜岛素类似物或膜岛素类似物复合物投用给需要其的个体的步骤。
[001引[发明的效果]
[0017] 本发明的非天然膜岛素类似物不仅提供膜岛素效价低于天然膜岛素且因对膜岛 素受体的结合力减少而规避在生物体内的清除机制，增加在生物体内的血液中的半衰期的 膜岛素类似物，而且利用该种膜岛素类似物的膜岛素类似物-免疫球蛋白化复合物可通过 大幅增加在血液中的半衰期而提高需投用膜岛素的患者的便利性。
【附图说明】
[0018] 图1是表示通过蛋白质电泳方式对膜岛素类似物的纯度进行分析的结果的图。其 是对作为代表性的膜岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。第1色带；尺寸标记 (sizemarker)，第2色带；天然膜岛素，第S色带；膜岛素类似物（第7号）。
[0019] 图2是通过高压色谱法对膜岛素类似物的纯度进行分析的结果。其是对作为代 表性的膜岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。图2(A)为RP-HPLC，图2炬）为 沈-册LC。
[0020] 图3是对膜岛素类似物的肤图谱进行分析的结果。关于膜岛素类似物，对作为代 表性的类似物的第7号类似物进行了分析。图3(A)为天然膜岛素，图3炬）为膜岛素类似 物（第7号）。
[0021] 图4是通过蛋白质电泳方式对膜岛素类似物-免疫球蛋白化复合物的纯度进行 分析的结果。其是对作为代表性的膜岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。第1色 带：尺寸标记（sizemarker),第2色带；膜岛素类似物（第7号）-免疫球蛋白化复合物。
[0022] 图5是通过高压色谱法对膜岛素类似物-免疫球蛋白化复合物的纯度进行分析 的结果。其是对作为代表性的膜岛素类似物的第7号类似物进行分析的结果。图5(A)为 RP-HPLC，图 5 炬）为SE-HPLC，图 5 (C)为IE-HPLC。
[0023] 图6是表示天然膜岛素-免疫球蛋白化复合物及膜岛素类似物-免疫球蛋白化 复合物在正常大鼠中的药代动力学分析的结果。其是对作为代表性的膜岛素类似物的第7 号类似物进行分析的结果。〇;天然膜岛素-免疫球蛋白化复合物（21. 7nmol/kg)，?：天 然膜岛素-免疫球蛋白化复合物化5.Inmol/kg)，□;膜岛素类似物-免疫球蛋白化复合 物（21. 7nmol/kg)，;膜岛素类似物-免疫球蛋白化复合物化5.Inmol/kg)。图6(A)为 天然膜岛素-免疫球蛋白化复合物及膜岛素类似物（第7号）-免疫球蛋白化复合物，图 6炬）为天然膜岛素-免疫球蛋白化复合物及膜岛素类似物（第8号）-免疫球蛋白化复 合物，图6(C)为天然膜岛素-免疫球蛋白化复合物及膜岛素类似物（第9号）-免疫球蛋 白化复合物。
【具体实施方式】
[0024]作为一实施方式，本发明提供一种膜岛素类似物，其膜岛素效价低于天然膜岛素 类似物且B链或A链的氨基酸发生变异。
[0025]作为一具体例，本发明提供一种对膜岛素受体的结合力减少的膜岛素类似物。
[0026] 作为又一具体例，本发明提供一种选自由B链的第8号氨基酸、B链的第23号氨 基酸、B链的第24号氨基酸、B链的第25号氨基酸、A链的第1号氨基酸、A链的第2号氨 基酸、及A链的第14号氨基酸所构成的群组中的一种氨基酸被丙氨酸取代而成的非天然膜 岛素类似物。
[0027] 作为又一具体例，本发明提供一种选自由序列号20、序列号22、序列号24、序列号 26、序列号28、序列号30、序列号32、序列号34、及序列号36所构成的的群组中的膜岛素类 似物。
[0028]作为另一实施方式，本发明提供一种膜岛素类似物复合物，其是在如上所述的膜 岛素类似物连接可延长半衰期的载体而成。
[0029] 作为一具体例，提供一种利用（化）肤连接子或非肤连接子连接所述膜岛素类似 物及（ii)免疫球蛋白化区而成的膜岛素类似物复合物，所述非肤连接子选自由聚己二 醇、聚丙二醇、己二醇-丙二醇共聚物、聚氧己基化多元醇、聚己締醇、多糖、葡聚糖、聚己締 己離、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳素类、透明质酸及它们的组合所构成的群组。
[0030]作为另一实施方式，本发明提供一种膜岛素长效制剂，其包含所述膜岛素类似物 复合物，且在生物体内的长效性及稳定性增加。
[0031] 作为一具体例，提供一种用于治疗糖尿病的膜岛素长效制剂。
[0032] 作为又一实施方式，本发明提供一种所述膜岛素类似物复合物的制造方法。
[0033] 作为又一实施方式，本发明提供一种利用所述膜岛素类似物、或膜岛素类似物及 载体结合而成的膜岛素类似物复合物来增加在生物体内的半衰期的方法。
[0034] 作为又一实施方式，本发明提供一种治疗与膜岛素相关的疾病的方法，所述方法 包含将所述膜岛素类似物或膜岛素类似物复合物投用给需要其的个体的步骤。
[0035] 本发明设及一种in-vitro效价减少的膜岛素类似物。该种膜岛素类似物的特征 在于，因使用非天然膜岛素序列而对膜岛素受体的结合力低于天然膜岛素，因此因解离常 数来减少借助受体介导的清除（rec巧tor-mediatedclearance)，并增加血液中的半衰期。
[0036] 在本发明中，术语"膜岛素类似物"包含相比于天然型膜岛素类似物，膜岛素效价 减少的多种类似物。
[0037] 所述膜岛素类似物可W为相比于天然型膜岛素类似物，膜岛素效价减少的，膜岛 素的B链或A链的氨基酸发生变异的膜岛素类似物。天然型膜岛素氨基酸序列如下。
[0038]-A链；
[0039]Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-A sn-Tyr-切s-Asn(序列号 37)
[0040]-B链；
[0041]Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-V al-切s-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-T虹-Pr〇-Lys-T虹（序列号 38)
[0042] 在本发明的实施例中所使用的膜岛素类似物虽然是通过基因重组技术来制成的 膜岛素类似物，但本发明并不局限于此，而是包含减少in-vitro效价的所有膜岛素。优 选地，可W包含倒置膜岛素（invertedinsulin)、膜岛素变异体（variants)、膜岛素片段 (化agments)等，并且可W通过基因重组及固相（solid地ase)等制造方法来制造，但并不 局限于此。
[0043] 膜岛素类似物作为拥有与膜岛素相同的生物体内的血糖调节功能的肤，该种 肤包含膜岛素激动剂（agonist)、衍生物