多重核酸检测方法
【专利说明】多重核酸检测方法
【背景技术】
[0001] 本文所公开的实施方式设及核酸，更特别地是设及祀核酸序列多重检测的方法。
[0002] 多重连接依赖性探针扩增（MLPA)是允许在单次实验中评估特别是多种祀核酸的 拷贝数的多重PCR技术。在MLPA中，所查询的每个祀核酸是通过连接的探针的扩增来检测。 连接的探针是通过探针组的杂交和连接产生，所述探针组包含一对设计为沿目标祀核酸序 列彼此邻近定位的半探针化alf-probe)。只有在半探针与祀核酸杂交时，才发生连接和随 后的扩增。
[000引图1示出了典型的MLPA分析的流程图。该分析起始于DNA样品的变性和探针组 与它们的祀核酸序列的杂交。在杂交后，连接邻近的半探针，并使得到的连接的探针组经历 PCR扩增。然后通过毛细管电泳（C巧分析所扩增的连接的探针组。CE读出结果的峰高度 作为基因组祀拷贝数的读出结果。
[0004] 如图1中所指示的，每个探针组由具有祀特异性序列和通用引物序列的5'和3' 半探针组成，允许同时多重PCR扩增所有连接的探针组。另外，半探针中的一个（如图1所 示）或两者进一步包括填充序列（S化ffersequence),其使得更容易区分通过CE进行的扩 增探针的检测。使用使得基于核酸长度的CE检测成为可能的该些填充序列对于可在单次 运行中查询（query)的祀核酸数量造成限制。目前，该限制是约40个祀核酸。由于与MLPA 相关的低成本、高通量潜力和检测小重排的能力，扩增可在单次运行中查询的祀核酸序列 的数量是有益的。本公开提供了用于查询数量扩增的该样的方法并也提供相关的优势。
【发明内容】
[0005] 根据在本文中说明的实施方式，提供了增加可在多重连接依赖性探针扩增（MLPA) 分析中查询的祀核酸数量的方法。
[0006] 在一些方面，本文所公开的实施方式提供了用于多重连接依赖性探针扩增的方 法，其包括（a)提供样品组织W查询多个不同的祀核酸；化）为所述多个不同祀核酸中的每 一个提供多个不同的探针组，其中每个探针组包含；第一基因座（locus)特异性探针，其包 含第一接头（adapter)序列和第一祀特异性部分；和第二基因座特异性探针，其包含第二 接头序列，和邻近所述第一祀特异性部分的第二祀特异性部分；（C)将所述多个不同探针 组与所述多个不同祀序列杂交W形成多个杂交复合体；(d)连接所述多个杂交复合体W形 成多个连接的探针；（e)扩增所述多个连接的探针W形成多个扩增子，其中所述扩增步骤 使用第一通用引物和第二通用引物进行，所述第一通用引物包含与所述第一接头序列互补 的区域，所述第二通用引物包含与所述第二接头序列互补的区域；和化）通过对所述多个 扩增子的每一个进行测序，在检测系统中与长度无关地检测所述多个扩增子。
[0007] 在其他方面，本文所公开的实施方式提供了方法，其包括提供检测系统，所述检测 系统包括配置为在包含多个扩增子的阵列上进行合成测序循环的流体处理系统，所述检测 系统被配置为将福射从源引导至所述阵列并将巧光发射从所述阵列引导至照相机，和包括 配置为自动改变所述检测系统W增加引导至所述阵列的所述福射的暴露水平和在所述增 加的暴露下检测从所述阵列到所述照相机的巧光发射的系统控制界面；通过多重连接依赖 性探针扩增提供所述多个扩增子；和测定所述多个扩增子的序列。
【附图说明】
[000引为更好地理解本实施方式，可参考附图。
[0009]图1示出了采用毛细管电泳检测系统的多重连接依赖性探针扩增（MLPA)的流程 图。
[0010] 图2示出了根据本文所公开的实施方式的MLPA-合成测序（SB巧的流程图。
[0011] 图3示出了根据本文所公开的实施方式的采用索引的MLPA-SBS的流程图。
[0012] 图4示出了根据本文所公开的实施方式，与进行性假肥大性肌营养不良 (DuchenneMus州larDystro地y，DMD)基因有关的79个外显子的阅读片段计数对外显子 数量的图，说明了使用单运行MLPA-SBS系统检测男性、女性和对照样品中的拷贝数变异。
[0013] 图5示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数目的如图4中的另一个 实例。女性样品在上面，男性样品在下面示出。方框中强调的是来自具有外显子3到17的 缺失的男性（卡瑞尔DNA样品编号NA03782)的阅读片段计数。
[0014] 图6示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一 个实例。方框中强调的是来自具有外显子46到50的缺失的男性（卡瑞尔DNA样品编号 NA03929)的阅读片段计数。
[0015] 图7示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一 个实例。方框中强调的是来自具有外显子49到52的缺失的女性（卡瑞尔DNA样品编号 NA04099)的阅读片段计数。
[0016] 图8示出了标准化读数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个实例。 方框中强调的是来自具有外显子49到52的缺失的男性（卡瑞尔DNA样品编号NA04100， NA04099的儿子）的阅读片段计数。
[0017] 图9示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一个 实例。方框中强调的是来自具有外显子44的缺失的女性（卡瑞尔DNA样品编号NA04315) 的阅读片段计数。
[001引图10示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另 一个实例。方框中强调的是来自具有外显子5到7的重复的男性（卡瑞尔DNA样品编号 NA04327)的阅读片段计数。
[0019] 图11示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一 个实例。方框中强调的是来自具有外显子51到55的缺失的男性（卡瑞尔DNA样品编号 NA04364)的阅读片段计数。
[0020] 图12示出了标准化阅读片段计数对DMD基因中的外显子数量的如图5中的另一 个实例。方框中强调的是来自具有外显子45到53的缺失的男性（卡瑞尔DNA样品编号 NA04981)的阅读片段计数。
[002。 发巧详巧
[0022] 在W下描述中，应理解可W使用其他实施方式并且可W进行结构和操作的改变而 不背离本文所公开的本实施方式的范围。
[0023] 根据本文所公开的实施方式，提供了可允许将可W在多重连接依赖性探针扩增 (MLPA)分析中查询的祀核酸数量从每运行约40个祀核酸序列的当前限制大幅增加的方 法。例如，使用用于检测扩增产物的合成测序（SB巧系统可W消除由基于CE的检测系统设 置的查询数量限制。实际上，本文所公开的方法中查询的祀序列数量只需要受到适合探针 组的可获得性的限制。
[0024] 而且，通过消除对于作为区分扩增的探针产物的手段的填充序列的需求，采用SBS 检测系统可W简化探针组设计，并因此可W减少与开发探针组有关的成本。SBS检测系统 可与扩增探针的长度无关的方式利用探针组的任选的索引。有利地，采用具有索引的 SBS检测系统可W帮助例如同时查询多个患者/组织样品。最后，SBS检测可W提供增强的 检测灵敏度，允许相对于基于CE的技术减小样品大小。
[0025] 在一些实施方式中，提供了用于多重连接依赖性探针扩增的方法，其包括（a)提 供样品组织W查询多个不同的祀核酸；化）针对所述多个不同祀核酸中的每一个提供多个 不同的探针组，其中每个探针组包含；第一基因座特异性探针，其包含第一接头序列和第一 祀特异性部分；和第二基因座特异性探针，其包含第二接头序列，和邻近所述第一祀特异性 部分的第二祀特异性部分；（C)将所述多个不同探针组与所述多个不同祀序列杂交W形成 多个杂交复合体；（d)连接所述多个杂交复合体W形成多个连接的探针；（e)扩增所述多 个连接的探针W形成多个扩增子，其中所述扩增步骤使用第一通用引物和第二通用引物进 行，所述第一通用引物包含与所述第一接头序列互补的区域，所述第二通用引物包含与所 述第二接头序列互补的区域；和（f)通过对所述多个扩增子的每一个进行测序，在检测系 统中与长度无关地检测所述多个扩增子。
[0026] 本文所公开的实施方式提供了多种不同的核酸作为引物和探针/探针组。本文 中使用的"核酸"或语法等同词语是指共价地连接在一起的至少两个核巧酸。核酸一般含 有磯酸二醋键，虽然在一些情况下，特别是对于用于探针的情况，可具有替代性骨架的核酸 类似物可W被包括在内，所述替代性骨架包括，例如，磯酷胺炬eaucage等，Tetr址e化on 49 (10): 1925 (1993)及其中的参考文献；Letsinger，J.Org.Chem. 35:3800(1970);Sprinzl 等，Eur.J.Biochem. 81:579(1977);Letsinger等，Nucl.AcidsRes. 14: ：M87 (1986); Sawai等，Qiem.Lett.805(1984)，Letsinger等，J.Am.Chem.Soc. 110:4470(1988);和 Pauwels等，QiemicaScripts26:1419(1986))、硫代磯酸醋（Mag等，NucleicAcids Res. 19:1437 (1991);和美国专利号 5644048)、二硫代磯酸醋炬riu等，J.Am.Chem. Soc. 111:2321(1989))、0-甲基亚磯酷