用于核酸测定的对照的制作方法
【专利说明】用于核酸测定的对照
[00(川相关申请 该申请要求享有对2012年8月30日提交的美国临时申请号61/695, 116的优先权。该 申请的内容在此通过引用W其整体并入本文。
[000引序列表的并入 于2013年8月30日创建并且大小为1邸、命名为"41432-508001W0_ST25.txt"的文 本文件的内容，在此通过引用W其整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明设及通过在分离或提取方法的不同步骤中使用对照颗粒从微泡 (microvesicle)分离微泡级分和核酸的试剂盒和方法。
[0004] 背景 将通过细胞释放的膜结合小泡描述为"微泡"。微泡可W包括外来体、外来体样颗 粒、前列腺小体、外泌体（dexosomes)、肿瘤细胞胞外体（texosomes)、核外颗粒体、核内体 (oncosomes)、调亡小体、逆转录样颗粒和人内源性逆转录病毒（肥RV)颗粒。研究已经显示 处于正常和病理状况的多种不同细胞类型释放微泡（The巧等，2002)。重要地，已经显示 微泡含有DNA、RNA和蛋白质。最近的研究已经显示微泡的内容物的分析已经揭示生物标记 物或疾病相关基因可W被检测，因此，证明了微泡分析用于帮助对疾病或其它内科疾病的 诊断、预后、监测或治疗选择上的价值。
[0005] 使用了多种分子诊断测定，W检测疾病相关生物标记物，并且为患者、医生、临床 医师和研究者提供了有价值的信息。用于诊断目的的从微泡提取的核酸的分析由于其非 侵入的性质（微泡可W容易地收集到其中）而具有广范的影响。微泡分析的使用替代侵入 性活组织检查（invasivetissuebiopsy)会积极影响患者福利，改善进行纵向疾病监测的 能力，并且改善获得表达概况的能力，即使在当组织细胞不容易得到时(例如，在卵巢癌和 脑癌患者中）。因此，需要开发额外的工具W确保在临床领域使用的诊断性微泡分析的一致 性、可靠性和适用性。没有适当的内部对照，核酸分析结果可能是不一致的并且因此对临床 诊断不实用。为解决在微泡诊断领域内的该需求，本发明提供了使用对照颗粒作为用于分 离微泡和/或从微泡提取核酸方法的内部对照的方法和试剂盒。
[000引发明概述 本发明设及使用对照颗粒作为内部对照，用于分离微泡和/或从微泡提取核酸的方 法，和可用于该方法的对照颗粒。特定地，本文中提供的方法对鉴别从分离的微泡中提取的 高质量提取的核酸样品有用，其适合用于进一步诊断或预后分析。
[0007] 本发明特征在于从生物样品分离微泡和/或从微泡提取核酸的方法，其通过；a) 向生物样品添加含有对照核酸的已知量的对照颗粒，b)从生物样品分离级分，C)从级分提 取核酸，d)计算从分离和核酸提取步骤回收的对照颗粒的量，并且e)确定对照颗粒回收的 量(在（d)中计算）是在预定数值范围内，W鉴别微泡分离和/或核酸提取的质量。提取的 核酸包括来自微泡的核酸和来自对照颗粒的对照核酸。计算步骤可W包括确定对照颗粒的 对照核酸的表达水平或拷贝数量。在另一个实施方案中，对照颗粒可w在微泡级分分离后 和核酸提取步骤之前添加至样品。
[0008] 如果在步骤（d)中计算的对照颗粒的量在预定数值范围内，则微泡分离和/或核 酸提取的质量是高的。如果在步骤（d)中计算的对照颗粒的量不在预定数值范围内（即，在 范围之外)，则微泡分离和/或核酸提取的质量是高的。
[0009] 预定数值范围根据参考样品（即，患者组群（patientcokxrt))的集合确定。例 如，计算来自参考样品集合的全部回收的或检测的对照核酸的表达水平（即，Ct值）的平均 值和标准偏差。预定数值范围可W是，例如，距离参考样品集合的回收的对照核酸的平均表 达水平（即，Ct值）1个标准偏差、2个标准偏差、3个标准偏差、4个标准偏差或5个标准偏 差。
[0010] 本发明提供了用于分离微泡和从分离微泡提取核酸的方法的内部对照，W鉴别对 于疾病相关生物标记物的准确的和可靠的进一步分析为高质量的提取的核酸样品。例如， 对于与医疗状况或疾病相关的至少一种生物标记物的存在、不存在或水平的改变，对提取 的核酸进一步分析，W诊断、预测或监测疾病或医疗状况。通过实时PCR(real-timePCR) 执行对照核酸表达水平或至少一种生物标记物的存在、不存在或水平改变的分析。
[0011] 对照颗粒是病毒颗粒，诸如RNA瞻菌体。优选地，对照颗粒是Q- 0瞻菌体。对照 核酸是编码Q-0外壳蛋白的基因或其片段。对照颗粒可W是天然生成的或重组的或工程 改造的病毒颗粒。
[0012] 生物样品是体液。体液可W是从主体身体的任何部位分离的流体，优选地外周位 置，包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、尿液、疲、脊髓液、脑脊液、胸膜液、乳头抽吸液、 淋己液、呼吸道，肠道和泌尿生殖道流体、泪液、唾液、乳汁、来自淋己系统流体、精液、脑脊 液、内脏系统流体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水和其组合。例如，体液是尿液、血液、血清或脑脊 液。
[001引在任何前述方法中，核酸是DNA或RNA。RNA的实例包括信使RNA、转移RNA、核糖 体RNA、小RNA(非蛋白质编码RNA、非信使RNA)、微小RNA、piRNA、exRNA、snRNA和snoRNA。
[0014] 本发明提供了包含对照颗粒的用于从生物样品分离微泡级分和/或微泡核酸，用 于与疾病或医疗状况相关的至少一种生物标记物的检测的试剂盒，其包括已知量的包含对 照核酸的对照颗粒，用于对照核酸杂交和扩增的引物，和任选地，用于生成标准曲线的一组 已知浓度的对照核酸，和任选地，在从生物样品分离微泡级分中使用上述试剂的说明书。
[0015] 本发明同样提供了用于确定从微泡级分的核酸提取和/或核酸提取的质量的试 剂盒，其包括已知量的包含对照核酸的对照颗粒，用于对照核酸杂交和扩增的引物，和任选 地，用于生成标准曲线的一组已知浓度的对照核酸，和任选地，使用上述试剂用于确定从生 物样品的微泡提取和/或核酸提取的质量的说明书。
[0016] 本发明的多个方面和实施方案现在将详细描述。将会理解的是可W在不偏离本发 明范围的情况下进行细节的修饰。进一步的，除非上下文中另有要求，单数术语应当包括复 数并且复数术语应当包括单数。
[0017] 确定的全部专利、专利申请和出版物，为描述和公开目的明确通过引用并入本文， 例如，在该些出版物中描述的方法学可结合本发明使用。提供该些出版物仅由于它们在本 申请提交日之前公开。在该点上没有任何情况应理解为承认发明人无权凭借在先发明或为 了任何其它理由先于该样的公开。全部关于日期的声明或关于该些文件内容的表示是基 于对于申请人可W得到的信息，并且不应构成对该些文件的日期和内容的正确性的任何承 认。
[0018] 附图简述 图1A是在血清样品中Q-0外壳蛋白基因的RT-PCR分析中的扩增曲线绘图。X轴代表PCR扩增循环的数量。Y轴代表标准化巧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生的信号量 级。
[0019]图1B是用于在RT-PCR分析中绘制在血清样品中Q-0外壳蛋白基因的Ct值的标 准曲线。X轴代表每个反应拷贝数量的浓度。Y轴代表在RT-PCR分析中的Ct值。
[0020] 图2A是在尿液样品中Q-0外壳蛋白基因的RT-PCR分析中的扩增曲线绘图。X轴 代表PCR扩增循环的数量。Y轴代表标准化巧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生的信 号量级。
[002。图2B是用于在RT-PCR分析中在尿液样品中绘制Q-0外壳蛋白基因的Ct值的标 准曲线。X轴代表每个反应拷贝数量的浓度。Y轴代表在RT-PCR分析中Ct值。
[002引图3A是在尿液样品中白蛋白基因和18srRNA的RT-PCR分析中的扩增曲线绘图。X轴代表PCR扩增循环的数量。Y轴代表标准化巧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生 的信号量级。
[0023] 图3B是在尿液样品中GAPDH基因的RT-PCR分析的扩增曲线绘图。X轴代表PCR 扩增循环的数量。Y轴代表标准化巧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生的信号量级。
[0024] 图4是通过连续去除具有高Q-0 Ct的样品在样品中关联PCA3 AUC值的两幅图。 在上图中，Y轴代表AUC值并且X轴代表通过减少Q-0至平均Q-0的距离(标准偏差）排 除的样品。在下图中，Y轴代表用作截止值的Q-0至平均值的距离(标准偏差)并且X轴代 表通过减少Q-0至平均Q-0的距离(标准偏差）排除的样品。
[00幼发明详述 本发明部分地基于下列发现；在用于从生物样品中分离微泡和提取微泡核酸的方法中 可W使用Q-0瞻菌体作为对照颗粒。在分离和/或提取过程期间通常使用内部对照W确 定方法的效率，或所获得的分离或提取的质量。本方法使用与微泡大小相似的对照颗粒(诸 如Q-P瞻菌体）作为微泡分离和从分离的微泡提取的核酸的效率、质量或纯度的对照。
[0026]由细胞释放的直径< 0.8化的全部囊泡在本文中共同地指的是微泡。该可W包括 外来体、外来体样颗粒、前列腺小体、外泌体（dexosomes)、肿瘤细胞胞外体（texosomes)、 核外颗粒体、核内体（oncosomes)、调亡小体、逆转录样颗粒和人内源性逆转录病毒（肥RV) 颗粒。对来自多种细胞来源的微泡关于蛋白质和脂质含量已经进行了充分研究。
[0027] 微泡在先前已经显示出是有价值的诊断和预后工具。初步研究证明成胶质细胞瘤 来源的微泡可W从成胶质细胞瘤患者的血清中分离。重要地，该些微泡含有与肿瘤细胞相 关的mRNA。该些微泡中的核酸可W用作有价值的生物标记物，用于肿瘤诊断、表征和预后。 例如，通过分析随时间或随疗程是否获得了其它突变，可W使用微泡中的核酸监测随时间 的肿瘤进展。此外，可W同样确定疾病相关基因的水平，并且编译为基因表达概况，其可W 与参考概况相比较，W诊断或预测疾病或监测疾病或治疗方案的进程。
[0028] 本发明基于如下发现；Q-0瞻菌体颗粒可W在从生物样品进行的微泡纯化/分离 和微泡核酸提取的多个步骤中添加至样品w充当内部对照。因此，本发明提供了在从生物 样品的微泡中提取核酸期间添加对照颗粒的方法，其中对照颗粒充当用于分离微泡和从其 中分离核酸的内部对照。在一个方面，在纯化微泡之前将对照颗粒添加至生物样品。在另 一个方面，在核酸提取之前将对照颗粒添加至纯化的微泡级分。微泡级分或提取的微泡核 酸的质量或纯度可W直接地影响用于疾病诊断