用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团衍生物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于检测多硫化半胱氨酸（CysSnSSH，n>l)的荧光探针，具体的说是一 种用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团（BODIPY)衍生物及其应用。
【背景技术】
[0002] 细胞内的活性硫物种是含硫生物分子的总称，比如谷胱甘肽，半胱氨酸和硫化氢 等。这些分子在生命体中参与着重要的生理和病理的作用。在生物系统中，内源性硫化氢 的产生及其生理作用，使得这种气体成为一氧化氮和一氧化碳气体信号分子家族中的重要 一员。在正常的生理条件下，硫化氢主要以HS存在。也就是说，HS可能是负责各种重要 物质的调节和新陈代谢。硫化氢在氧化剂的存在下会转化为硫烷硫，比如多硫化氢，聚硫化 氢，聚硫化物等。这些物质在细胞内的浓度约为微摩尔左右。然而，研究表明，与HS相比， 硫烷硫更容易与亲电基团发生反应而表现出亲核性，除此之外还具有抗氧化，细胞保护和 氧化还原性质，对细胞的氧化还原信号有调节作用。
[0003] 哺乳动物体内的H2S主要通过含硫的半胱氨酸代谢生成。胱硫醚-y-裂解酶 (eystathionine-y-lyase，CSE)和脫硫酿-(6-合成酶（cystathionine-0-synthase， CBS)是体内转硫途径的关键酶，对H2S的产生以及含硫化合物的代谢具有重要调节作用， CSE主要在主动脉、肺动脉、尾动脉、肠系膜动脉和门静脉上有表达；相反CBS主要分布在神 经系统内；在回肠、肾脏和肝脏中则同时有CBS和CSE的表达；一些种类的癌细胞也可产生 H2S。然而，最新研究发现以胱氨酸为底物的胱硫醚P-合成酶或胱硫醚Y-裂解酶首先合 成的是硫烷硫而不是硫化氢。多硫化半胱氨酸（CysSnSSH)是硫烷硫的一种，在哺乳动物细 胞中广泛存在。CysSnSSH可以通过胱硫醚-y-裂解酶和胱氨酸反应得到。然而，CysSnSSH 的生物相关性还不清楚。据文献报道，一些原来由硫化氢参与的生理活动，其实际上是由 CysSnSSH介导的。因此，CysSnSSH可能是潜在的重要信号物种。
[0004] 尽管对CysSnSSH的研究兴趣越来越高，但是目前对其基本的化学活性了解甚少。 由于CysSnSSH很难从生物系统中直接分离，也加剧了对它的精确检测。因此，发展新的用 于评估CysSnSSH浓度的方法是亟需的。荧光分析法以其灵敏度高、选择性好、响应时间短 等优点，为检测生物分子提供了一种快速、实时、非侵入式检测方法。目前用于专一性检 测CysSnSSH的荧光探针还没有得到开发。由此可见，开发一种新的能够实现对生命体内 CysSnSSH进行靶向检测的生物医学工具将是该研究领域的突破点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团 (BODIPY)衍生物及其应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] -种用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团衍生物，荧光团衍生物如通式I 所示，
[0008]
[0009] 通式I中：
[0010] R1 (检测基团）为巯基苯甲酰基、硒酚苯甲酰基或碲酚苯甲酰基；
[0011] R2 (定位功能基团）为巯基苯甲酰基、硒酚苯甲酰基、碲酚苯甲酰基、丁基三苯基磷 基、N-丙基吗啉基、生物素基、叶酸基、糖基链基或C1 25烷基；
[0012] X为H或卤素；
[0013] Y为NSC;
[0014] Z为N或 0。
[0015] 优选：通式I中X为H;Y为N;Z为0时，所述用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯 类荧光团（BODIPY)衍生物通式II，为：
[0018] 其中，
[0019] R1为巯基苯甲酰基团、硒酚苯甲酰基团或碲酚苯甲酰基团；
[0020] R2为巯基苯甲酰基团、硒酚苯甲酰基团、碲酚苯甲酰基团、丁基三苯基鱗基团、 N-丙基吗啉基团、生物素基团、叶酸基团、糖基链基团或C1 25的烷基链；
[0021] 更优选，所述通式I中R1为连硫邻苯二甲酸；1?2为丁基三苯基鱗基团或N-丙基吗 啉基团；X为H;Y为N;Z为0。
[0022] -种用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团衍生物的应用，以所述通式I所 示的用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团衍生物作为多硫化半胱氨酸（CysSnSSH, n>l)的荧光探针。
[0023] -种荧光探针，荧光探针为通式I所示的用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧 光团衍生物，其以（BODIPY)荧光团作为荧光母体，并在母体对称的&或1?2位置引入对具备 线粒体、溶酶体、内质网、肝脏、癌组织的定位的功能团巯基苯甲酰基、硒酚苯甲酰基、碲酚 苯甲酰基、丁基三苯基磷基、N-丙基吗啉基、生物素基、叶酸基、糖基链基或C1 25烷基，以及 对称母体的另一个位置引入检测基团巯基苯甲酰基、硒酚苯甲酰基或碲酚苯甲酰基。
[0024] 所述荧光探针用于定性/定量的检测生理环境下、细胞或生物体内的CysSnSSH。
[0025] 荧光探针的反应原理是，将通式I与待测定水体、模拟生理环境或细胞内的 CysSnSSH反应从而导致荧光强度的改变，所得通式III结构的化合物；
[0026]
[0027] 将通式II结构应用于检测CysSnSSH时，其与CysSnSSH作用后，生成具有通式IV 结构的化合物，从而导致荧光强度的改变；
[0028]
[0029] 通式II可对CysSnSSH进行定性、定量的检测。
[0030] 本发明中使用的术语"烷基"包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如"丙 基"，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如"异丙基"，则只特指支链烷基。例如，"C1 6 烷基"包括C1 4烷基、Ci3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于 本说明书中使用的其它基团。
[0031 ] 本发明中使用的术语"卤素"包括氟、氯、溴和碘。
[0032] 本发明中使用的术语"苄基"是指-CH2-Ph基团。当用"任选取代"修饰苄基时，指 该苄基可以未取代的形式存在，或者可被合适的取代基在任何合适的位置取代。合适的取 代基包括但不限于汛(： 118烷基、^〇)011、順2、勵2、011、311、(：16烷氧基、(： 16烷基氨基、(：16酰 氨基、卤素、或C1 6卤代烷基等，只要最终形成的化合物具有本发明期望的性质。优选苄基 由C00H、NH2、0H、C1 6烷氧基、卤素任选取代。
[0033] 本发明中使用的术语糖基指单糖、双糖、类单糖或类双糖。
[0034] 本发明的有益效果：
[0035] 本发明化合物用于作为CysSnSSH荧光检测的探针，其在CysSnSSH存在下对应的荧 光强度发生变化，进而可用于水体系、模拟生理环境和细胞内CysSnSSH水平的检测。本发 明用于CysSnSSH荧光探针的这类化合物，在CysSnSSH存在下对应的荧光强度发生变化，可 用于CysSnSSH的检测，并可缩减样品处理时间、大大降低检测成本和提高检测精度。这类 化合物作为荧光探针可用于细胞内外CysSnSSH浓度的检测，不仅对阐明CysSnSSH对生物体 抗氧化和细胞保护性质具有重要的科学意义，而且为研究CysSnSSH介导的细胞的重要硫氧 化还原信号通路奠定理论基础。
【附图说明】
[0036] 图1为本发明实施例提供的采用的式一化合物对CysSnSSH检测前后荧光变化。 (a)加入CysSnSSH(IOyM)后，探针（IOyM)的紫外吸收光谱的变化。红线是探针的吸收光 谱。黑线是加入CysSnSSH后的吸收光谱；(b)加入CysSnSSHd- 10yM)后，式一化合物的 荧光光谱的变化。插图：不同CysSnSSH浓度在波长720nm处的荧光强度。光谱在IOmmol/ L的HEPES(pH7. 4)条件下获得，激发波长为680nm，发射波长为720nm〇
[0037] 图2为本发明实施例提供的所采用的式一化合物对CysSnSSH的选择性示意图； 在每组中，柱状图分别代表720nm处探针对活性硫物种在0, 3, 5,10,15分钟时的荧光响 应。（I)ImMCysSSSH;(2)lmMCys-poly_sulfide;(3)0.5mMCys+S8;(4)lmMCys;(5)lmM Hcy； (6)IOmMGSH； (7)ImMCysSSCys； (8)ImMGSSG； (9) 0. 5mMNaHS； (10) 0. 5mMNa2S2O3; (11)0. 5mMNa2SO4; (12)0. 5mMNaHSO3。数据在lOmmol/L的HEPES(pH7. 4)条件下获得，激 发波长为680nm，发射波长为720nm。
[0038] 图3式一化合物用于不同细胞内多硫化半胱氨酸的激光共聚焦成像。（a) (b)和 (c)为小鼠巨噬细胞（RAW264. 7) ; (d)，（e)和（f)人肺癌细胞（A549) ; (g)，（h)和⑴宫颈 癌细胞（Hela)。探针的激发波长为635nm，荧光发射收集窗口 700-800nm。（a) (d)和（g) 探针（IyM)孵育细胞15分钟，然后用细胞培养液冲洗细胞三次。（b) (e)和（h)细胞中加 入多硫化半胱氨酸后，然后孵育20分钟。（e)，（f)和（i)分别为明场图。
【具体实施方式】
[0039] 实施例用于进一步说明本发明，但本发明不限于实施例。
[0040] 实施例1.用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团（BODIPY)衍生物的制备：
[0041] 通式I中所示用于测定多硫化半胱氨酸氟硼吡咯类荧光团（BODIPY)衍生物由市 售的对羟基苯乙酮和苯甲醛反应，合成响应的荧光团BODIPY，然后在荧光团相应的位置分 别修饰上不同的定位基团。最后将修饰定位基团的荧光团与连硫邻苯二甲酸在二氯甲烷溶 剂中，由DMP和EDC催化反应，然后由二硫苏糖醇