-单磷酸类脂a的制备及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型低毒的Kdo2-单磷酸类脂A的制备及其应用，属于生物工程 领域。
【背景技术】
[0002] 脂多糖（LPS)，即细菌内毒素，是构成大多数革兰氏阴性细菌外膜外层的主要成 分，主要由Kdo2-类脂A(Kdo2-LipidA)，核心多糖（Core)和0-抗原（0-antigen)三部分 组成；其中Kdo2-类脂A是LPS的疏水端，其结构非常保守，连接着亲水的核心多糖和0-抗 原并协助二者粘附于细胞表面构成完整细胞壁。革兰氏阴性菌侵入宿主后会释放其表层的 LPS，LPS可以被宿主免疫细胞表面的Toll样受体4(TollLikeRec印tor4,TLR-4)识别， 继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-a、IL-6、IL_8等多种炎性细胞因子。其 中，Kdo2-类脂A是与TLR-4受体结合的主要部分，尤其是类脂A部分的精细结构决定了LPS 刺激细胞后释放的细胞因子种类和数量。
[0003] 野生型大肠杆菌和沙门氏菌的类脂A部分一般包含六条或七条脂肪酸链并在Cl 位和C4'位连有两个磷酸基团，具有较高的细胞毒性。而某些特殊结构的类脂A衍生物，则 显示出较低的毒性，可作为疫苗佐剂，非特异性地增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫 苗效率。但，由于类脂A分子水溶性非常低，在水相中不能展现有效的生物活性，所以近几 十年至今，基础科研或者临床上还是使用LPS粗样来对相应的类脂A衍生物生物活性进行 研究，但LPS由于核心糖及0抗原部分结构多样化，分子量大且不均一，无法通过质谱或核 磁共振的方法进行实时检测和快速鉴定，也暂无标准化的提取纯化方法。此外，目前生产类 脂A所采用的沙门氏菌是致病菌且合成多种不同结构类脂A，操作起来比较困难、产品不纯 且在水相体系生物活性不佳，还需吸附在某些盐表面才能与疫苗结合而更好的作用；实际 生产过程中涉及到酸/碱水解等多种化学处理，步骤繁多、成本高，而且在处理过程中会伴 随脂肪酸链的断裂，破坏化合物有效结构，影响产品质量和产量。
[0004] 大肠杆菌W3110是非致病菌，其LPS部分不包含0-抗原，只有Kdo2-类脂A与核 心多糖，且其Kdo2-类脂A部分结构单一，只包含两个2-酮-3-脱氧辛酸、六条脂肪酸链 和CUC4'位两个磷酸基团，从细胞内膜内侧开始合成，合成途径非常保守，因此大肠杆菌 W3110是优于沙门氏菌的工业生产出发菌株。而Kdo2-类脂A相对类脂A具有更好的双亲 性，易于直接提取和纯化，又能被ESI质谱直接检测鉴定，在水相体系也具有较好的溶解度 和生物活性。本发明改造大肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的Kdo2-单磷酸类脂A， 这种Kdo2-单磷酸类脂A不含核心多糖长链、仅由两个2-酮-3-脱氧辛酸、六条脂肪酸链 和C4'位单个磷酸基团构成。这种特别的Kdo2-单磷酸类脂A，便于分离提取和检测，工业化 生产效率高、成本低，且这种特别的Kdo2-单磷酸类脂A化合物保持了类脂A部分的有效的 免疫刺激活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是极具发展潜力的疫苗佐剂。 同时，本发明提供一种提取和纯化Kdo2-类脂A的标准化方法，步骤简单明了，易于操作。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种具有特殊结构、减毒的Kdo2-单磷酸 类脂A，其化学式为C11idH2mN2O36P,相对分子质量为2157. 37,是以P-(1'-6)连接的D-葡萄 糖胺二糖为骨架，6'位连接二a-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸（Kdo2)、4'位被磷酸化、3'位 连接（R)-3_(十四烷氧基）十四烷基、2'位氨基连接（R)-3-(十二烷氧基）十四烷基、3位 和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成，具体结构式如式I所示：
[0006]
[0007] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种能直接生产所述减毒Kdo2-单磷酸 类脂A的大肠杆菌基因工程菌E.coliW3110AwaaCFAIacIlacZ: :FnlpxE。Kdo2-类脂 A及其衍生物的各种结构现今无法通过化学方法合成，也没有自然存在的菌株能够直接合 成Kdo2-类脂A。本发明中所述大肠杆菌基因工程菌是将E.coliW3110染色体基因组中 waaCF、IacI基因发生缺失突变失活，IacZ基因内部分别敲入表达异源的FnlpxE基因所得。 该大肠杆菌基因工程菌无抗生素标记、生长过程中无需诱导剂，能够直接合成生产出特殊 结构的低毒Kdo2-单磷酸类脂A，且产物单一、纯度高、能够被直接提取且易于纯化；菌株具 有较高疏水性、较高自凝集能力以及较低抗生素抗性和更高使用安全性。
[0008] 其构建方法主要包括以下步骤：首先，敲除野生型大肠杆菌W3110染色体上的 IacI基因，IacI基因编码Iac操纵子中的调节蛋白，敲除该基因可以解除调节蛋白对 后期插入IacZ位点的外源基因表达的阻遏作用，使外源基因形成组成型表达；其次，在 W3110AIacI菌株的基础上，在染色体IacZ位点处敲入FnlpxE基因，IpxE来源于弗朗西 斯菌，其编码的蛋白酶可以水解类脂A分子1位上的磷酸，构建得到中间菌株HffOOl;再次， 在HffOOl的基础上敲除染色体上的waaC-waaF基因簇，构建出菌株BWOOl，使菌株缺失核心 多糖第一第二个糖基转运酶，从而不连接外核心多糖直接生产出Kdo2-单磷酸类脂A。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，构建的IacI敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 1 所示。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，构建的FnlpxE-Fkan插入片段的核苷酸序列如SEQ IDNO. 2 所示。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，构建的waaCF敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 3 所示。
[0012] 本发明还提供一种方便快捷的应用所述大肠杆菌基因工程菌生产Kdo2-类脂A的 方法，主要包括以下步骤：
[0013] (1)培养菌体：采用一般摇瓶发酵培养，将种子菌液转接并培养至稳定期初期。
[0014] (2)提取分离：收集菌体，采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法提取Kdo2-类脂A粗 样。
[0015] (3)DEAE纤维柱纯化：Kdo2-类脂A粗样混合着膜磷脂，通过上样于DEAE纤维柱再 经梯度洗脱，去除磷脂杂质，得到高纯度的Kdo2-类脂A。
[0016] 所述生产方法中不涉及致病菌，并且无需诱导剂，无需化学处理裂解糖链，菌株可 用于直接提取获得减毒Kdo2-单磷酸类脂A的大规模生产；且此株基因工程菌的Kdo2-单 磷酸类脂A产物单一，具有双亲性，在有机相和水相均有一定溶解度，是很好的疫苗佐剂候 选。
[0017] 传统类脂A的获得是先用苯酚提取脂多糖，再进行一系列水解、层析、纯化等过 程。本发明的特殊Kdo2-单磷酸类脂A具有良好的双亲性质，可以用氯仿甲醇混合体系直 接提取获得，方法类似于膜磷脂的提取，不用添加苯酚，也无需经过酸/碱水解，较类脂A的 提取过程更为简单。所提取的Kdo2-单磷酸类脂A样品可直接通过薄层层析（TLC)和电喷 雾质谱（ESI/MS)检测、分析，而通常脂多糖由于其含大量亲水性糖链，分子量过大，脂溶性 极低无法直接通过TLC和EIS/MS分析。
[0018] 在对细胞毒性、免疫刺激活性的评估中，单磷酸类脂A水溶性极低，免疫效果不 佳，在实际临床时一般还需与其他佐剂结合或吸附于铝盐表面才能更好地发挥作用。本发 明的特殊结构Kdo2-单磷酸类脂A样品在水相细胞培养体系中也呈现较高的溶解度，保持 了类脂A部分的生物活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，再加上特殊结构赋 予的双亲性也更有利于其与疫苗成分以多种形式结合，是极具发展潜力的疫苗佐剂候选。
【附图说明】
[0019] 图1基因工程菌BWOOl所生产Kdo2-单磷酸类脂A的TLC分析
[0020] I:WBB06Kdo2-类脂A样品；2:BWOOIKdo2-单磷酸类脂A样品
[0021] 图2基因工程菌BWOOl所生产Kdo2-单磷酸类脂AESI/MS分析
[0022] A:WBB06Kdo2-类脂A样品；B:BWOOIKdo2-单磷酸类脂A样品
[0023] 图3野生型大肠杆菌W3IlOLPS与基因工程菌BWOOIKdo2-单磷酸类脂A刺激小鼠 巨噬细胞RAW264. 7毒性分析
[0024] 图4野生型大肠杆菌W3IlOLPS与基因工程菌BWOOIKdo2-单磷酸类脂A刺激人巨 噬细胞THP-I毒性分析
[0025] 图5野生型大肠杆菌W3110与基因工程菌BWOOl的疏水性与自凝集特性分析
[0026] 图6野生型大肠杆菌W3110与基因工程菌BWOOl的抗生素抗性分析
【具体实施方式】
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