一种难溶多肽的合成-分离纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程和多肽生产领域，具体的说涉及一种难溶多肽的合成-分离 纯化方法。
【背景技术】
[0002] 溶解性是研究蛋白质和多肽会遇到比较重要的问题，每个氨基酸都有其固有的化 学特性。如亮氨酸、异亮氨酸、颉氨酸是疏水性的，而赖氨酸、组氨酸、精氨酸是亲水性的。难 溶多肽主要是其包含的难溶氨基酸引起的，一般来说，难溶氨基酸占多肽比例超过75 %就 会造成多肽的难溶。
[0003] 在多肽化学发展的早期，多肽合成是在也相中进行的，虽然具有产出纯度高的优 势，但中间体的纯化步骤繁琐、耗时，对于多肽生产企业来说成本太高。而将多肽合成在固 相载体上完成，相比液相合成具有显著的优越性，但合成的纯度不够，必须进一步纯化，多 肽主要的纯化手段是反相高效液相色谱，其具有分离效果好，分辨率高回收率高的特点。反 相高效液相色谱在对多肽进行分离纯化时，需要将多肽完全溶解到溶剂中，最适合的常规 溶剂为H20、ACN，这样才能利用反相高效液相色谱进行有效的分离纯化，但难溶多肽无法溶 解在水/乙腈溶液中，给广大科研人员在该操作带来极大麻烦。
[0004] 现有解决难溶多肽纯化的方法是选择优良的有机溶剂（如：DMSO,DMF)去溶解多 肽，然后进行反相高效液相色谱分离纯化。但DMSO有毒性，使用时须考量适当的浓度；而 DMF或DMSO是通过破坏多肽的二级结构助溶，会导致高效液相色谱分离效果大大降低，且 对难容肽链的溶解能力有限。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明的目的是提供一种难溶多肽液合成、分离纯化方法，用于克服难 溶多肽在液相色谱分离纯化难溶性的问题。
[0006] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种难溶多肽的合成-分离纯化方 法，包括如下步骤：
[0007] (1)利用王氏树脂为起始树脂，采用固相合成法逐一偶联具有保护基团的亲水氨 基酸，每当偶联一个被保护的亲水氨基酸后，加入DIC和HOBt进行缩合，反应完全后洗涤， 再偶联下一个被保护的亲水氨基酸，获得王氏树脂-亲水多肽链；
[0008] (2)向步骤（1)获得的产物中加入连接臂至缩合反应完全；
[0009] (3)逐一加入具有保护基团的难溶氨基酸，每当偶联一个具有保护基团的难溶氨 基酸，加入DIC和HOBt进行缩合，反应完全后洗涤，再偶联下一个被保护的难溶氨基酸，直 至偶联到最后一个难溶氨基酸；
[0010] ⑷加入切割剂裂解树脂，取过滤母液加入乙醚析出，离心沉淀获得亲水多肽-连 接臂-疏水多肽粗品；
[0011] (5)将上一步骤获得的粗品多肽溶解，利用高效液相色谱分离提纯；
[0012] (6)将纯化后的粗品多肽用LiOH饱和溶液进行酯键水解，析出难溶多肽。
[0013] 其中，所述步骤（1)和步骤（3)中，加入具有保护基团的亲水氨基酸或难溶氨基酸 后，在30°C下反应1小时。
[0014] 而在所述步骤（3)中，在合成了王氏树脂-亲水多肽连后-连接臂后，加入第一个 具有保护基团的难溶氨基酸时，除了加入DIC和HOBt，还加入了DMAP并在30°C下缩合反应 5小时。
[0015] 所述连接臂是1，4位分别被羟基烷基和羧基烷基取代的苯化合物。具体地说，连 接臂来自4-羟基苯甲酸、对羟甲基苯甲酸、4-(2-羟乙基）苯甲酸、4-(3-羟基丙基）苯甲 酸、4-(4-羟基丁基）苯甲酸、对羟基苯乙酸、4-(羟甲基）苯乙酸、对羟基苯丙酸、3-[4-(羟 基甲基）苯基]丙酸、4-(4-羟基苯基）丁酸、2-(4-羟基苯）丙酸、3-(4-羟基苯基）丁酸、 2_[(4_羟基苯基）甲基]氨基丁酸、4-(1-羟基乙基）-苯甲酸的任意一种，通过常规脱水缩 合反应与亲水多肽链的N端连接。作为本发明的优选方案，所述连接臂为4-羟基苯甲酸、 对羟甲基苯甲酸、4-(2-羟乙基）苯甲酸、对羟基苯乙酸、4-(羟甲基）苯乙酸的任意一种。
[0016] 所述亲水多肽链优选为不同的亲水氨基酸脱水缩合而成。亲水氨基酸是精氨酸、 赖氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸的任意一种，这些氨基酸的 疏水参数很小；而本针对的难溶多肽，可以理解为包含难溶氨基酸且在液相色谱中溶解度 很低或难溶的多肽链，难溶氨基酸包括丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨 酸、异亮氨酸的任意一种，这些氨基酸疏水参数大，含有这些氨基酸的多肽链一般溶解度都 非常低。亲水氨基酸和疏水氨基酸具体如表1、表2所示：
[0017] 表1亲水氨基酸列表
[0022] 本发明是基于固相合成发逐一偶联或的肽链，步骤（1)和步骤（3)中加入的氨基 酸须进行保护，其保护基团如表3所示：
[0023] 表3加入氨基酸的保护基团
[0024]
[0025] 本发明先通过连接臂偶联成亲水的多肽链，再进行高效液相色谱进行分离纯 化，所获得的纯品再通过LiOH饱和溶液水解，多肽链中的难溶多肽链直接析出，而连接 臂-亲水氨基酸要保证较好的溶解于水解环境中。为了达到此目的，在合成亲水多肽链 的时候要对其所用的亲水氨基酸进行甄选。所述亲水多肽链中的亲水氨基酸优选谷氨酸 或天冬氨酸，当谷氨酸和/或天冬氨酸总数目占总亲水氨基酸数目的30%~80%时，利用 X-Ph-Y- (B) "在液相色谱中分离纯化，最后再水解酯键的效果最好。
[0026] 所述步骤⑷中，切割剂为TFA、TIS、EDT，体积比为95 :3 :2。
[0027] 本发明中一些常用缩写及其含义如下：
[0028] HMBA 4_羟甲基苯甲酸，连接臂；
[0029] DICN，N' -二异丙基碳二亚胺，缩合剂；
[0030]DMAP 4-二甲氨基吡啶，作为超强亲核催化剂，增加羟基与羧基链接效率；
[0031] HOBT 1-羟基苯并三唑，用于防止消旋反应，减少副反应；
[0032] DMF 二甲基甲酰胺，反应溶剂；
[0033] TFA 三氟乙酸，用于裂解多肽与树脂；
[0034] TIS 三异丙基硅烷，用于更好地去除氨基酸保护基团；
[0035] EDT 乙二硫醇，用于更好地去除氨基酸保护基团；
[0036] ACN 乙腈，增加多肽在水溶液的溶剂度；
[0037] FmocN-荷甲氧羰基，官能团保护基团；
[0038] Pbf [ (2, 3-二氢-2, 2, 4, 6, 7-五甲基苯并呋喃-5-基）磺酰基，a-氨基保护 基团；
[0039] Boc 叔丁氧羰基，a-氨基保护基团；
[0040] Trt 三苯甲基，a-氨基保护基团；
[0041] OtBu 叔丁酯，a-氨基保护基团
[0042] 有益效果：本发明提供了一种难溶多肽的分离纯化方法，先通过固相合成将难溶 多肽链和亲水多肽连偶联，实现难溶多肽在高效液相色谱中的溶解，再利用LiOH饱和溶液 水解酯键断开难溶多肽链和亲水多肽链，使目标肽链直接析出，具有简易、高效的特点，用 该方法获得的难溶多肽产品完全可以达到客户要求标准。
【附图说明】 图1是本发明实施例1的多肽合成步骤流程示意图； 图2是本发明实施例2的多肽合成步骤流程示意图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
[0044] 实施例1
[0045] 本实施例针对难溶多肽ILVLLIII进行分离纯化，连接臂选用4-羟甲基苯甲酸 (HMBA)，通过连接臂连接DDDDDEEKEEEE亲水多肽链。其中，D表示天冬氨酸，疏水参数-3. 5， 利用OtBu保护官能团；E表示谷氨酸，疏水参数-3. 5,利用OtBu保护官能团，K表示赖氨酸， 疏水参数-3. 9,利用Boc保护官能团；这些氨基酸都采用Fmoc保护a-氨基进行固相合成。 如图1所示，具体合成步骤如下：
[0046] 称取IgFmoc-Glu(OtBu)-Wangresin树脂，执行[操作A]，即：加入哌啶：DMF= 1:4 (体积比）移除N端的Fmoc保护基团，温度控制在30 °C，反应20分钟，反应后利用DMF/ 甲醇各洗涤3次，利用茚三酮检测试剂检测，颜色为蓝色表示反应完全。
[0047] 然后执行[操作B]，S卩：加入初始树脂摩尔数两倍的DIC和H0BT，以及两倍量的具 有保护基团的氨基酸反应1小时，温度控制在30°C，反应结束后用DMF洗涤3次后，用茚三 酮检测颜色为无色，则说明反应完全。
[0048] 后续以[操作A]、[操作B]交替进行，只是在[操作B]中所加入的亲氨基 酸随着合成顺序的进行更换。其中具有保护基团的谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸分别为 Fmoc-Glu(OtBu) -OH、Fmoc-Asp(OtBu) -OH、Fmoc-Lys(Boc) -0H。如此反应直到连接完HMBA， 用茚三酮溶液验色为无色即说明反应完成。以上反应即获得X-Ph-Y-(B)n的亲水偶联肽链。
[0049] 基于上述获得的肽链，直接进行[操作B]，此处操作时，先加入DIC和H0BT，再加 入DMAP，且DMP的加入量仅为加入氨基酸摩尔倍数的十分之一，在30°C下反应时间延长至 5小时。并在后续步骤与[操作A]交替，直至获得王氏树脂-难溶多肽链-连接臂-亲水 多肽链。
[0050] 然后用IOmlTFA:TIS:EDT= 95% :3% :2%裂解树脂2