Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
【专利说明】Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用
[0001] 本申请是申请号为200680051538. 9、申请日为2006年11月22日的发明专利申请 的分案申请。
[0002] 相关申请
[0003] 本申请要求2005年11月23号提交的临时申请号为60/739, 462、2006年3月17 日提交的临时申请号为60/783, 322、2006年9月15号提交的临时申请号为60/844, 855的 优先权权益，上述申请通过参考整体并入本申请。
【背景技术】
[0004] 骨骼疾病，包括从骨质疏松到骨折，代表了一组病理状态，极少有可以有效针对这 些病理状态的药物制剂。取而代之的是，治疗的焦点集中在包括固化、运动和饮食改变物理 和行为干涉上。对于治疗各种骨骼疾病，有促进骨骼生长以及增加骨骼密度的治疗药剂将 是有益的。
[0005] 骨骼生长和矿化依赖于成骨细胞和破骨细胞这两种类型细胞的活性，尽管软骨细 胞和血管细胞也参与了这些过程的关键方面。发展地，骨骼形成通过两种机制发生，软骨内 成骨和膜内成骨，前者负责纵行骨形成，后者负责拓扑扁平骨如头骨骨骼的形成。软骨内成 骨要求顺序形成以及生长板内的软骨结构的降解，所述的生长板作为成骨细胞、破骨细胞、 血管细胞的形成以及随后的矿化的模板。在膜内成骨过程中，骨骼在结缔组织中直接形成。 这两种进程要求成骨细胞的浸润和后续的基质沉积。
[0006] 骨折以及其它的骨骼结构性破裂通过一种至少表面上类似骨生成的发育顺序的 过程来愈合，所述的骨生成的发育包括软骨组织形成以及随后的矿化。骨折愈合的过程可 以以两种方式发生。直接或初始的骨骼愈合的发生没有骨痂形成。间接或二级的骨骼愈合 的发生具有骨痂前体阶段。骨折的初期愈合涉及横跨紧密排布破裂的机械连接的改造。在 合适的条件下，围绕破裂的骨骼吸收细胞显示了隧道吸收应答，并构建穿刺血管以及随后 的愈合的通路。骨骼的二级愈合以炎症反应、软骨痂形成、骨痂矿化和骨痂重构的顺序进 行。在炎症反应阶段，血肿和出血形成源于损伤位置的骨膜以及骨内膜血管的破裂。炎性 细胞侵入该区域。在软骨痂形成阶段，细胞生成新的血管、成纤维母细胞、胞内物质和支持 细胞，在骨折破片间的间隙形成肉芽组织。横跨破裂的临床愈合通过纤维状的或软骨组织 (软骨痂）建立。成骨细胞形成并调节软骨痂的矿化，然后所述的软骨痂被板层骨所代替且 受限于正常的重构过程。
[0007] 除了骨折以及骨骼结构的其他物理破裂外，骨骼矿物质含量以及骨密度的丢失可 由多种不同的条件引起并且可能导致重要的医学问题。骨密度的改变以相对可预期的方式 发生于个体整个寿命期间。大约到30岁的时候，男性和女性的骨骼通过软骨内成骨生长盘 的线性生长和径向生长生长至最大质量。在大约30岁（对于松质骨，例如，扁平骨诸如椎 骨和骨盆）以及40岁（对于皮质骨，例如，在肢体中的长骨），男性和女性均发生缓慢的骨 丢失。在女性中，还存在最后阶段的实质骨骼丢失，也许是由于绝经后缺乏雌激素。在此 期间，女性可能在皮质骨上额外丢失10%的质量，以及在松质间隔上额外丢失失25%的质 量。进行性的骨骼质量丢失是否导致病理状况诸如骨质疏松严重依赖于个体的初始骨骼质 量以及是否存在加重的状况。
[0008] 骨丢失有时以正常骨骼重构过程的不平衡为特征。健康的骨骼经常受限于重构。 重构以骨骼被破骨细胞吸收开始。然后被吸收的骨骼被新的骨骼组织所代替，其特征在于 成骨细胞形成胶原并且随后钙化。在健康的个体中，吸收和形成的速率是平衡的。骨质疏 松症是一种慢性的、进行性的状况，以朝向吸收的转移为标记，导致骨骼质量的全面减少以 及骨骼矿化。人体的骨质疏松症先于临床的骨质减少（骨矿物质密度在年轻成年人的均值 以下大于一个标准差但小于两个标准差）。世界范围内，大致7亿5千万人具有骨质疏松的 风险。
[0009] 因此，控制破骨细胞和成骨细胞活性的方法对促进骨折和骨骼其它损伤的愈合以 及疾病（如骨质疏松，与骨骼质量的损失以及骨骼矿化相关）的治疗是有效的。
[0010] 关于骨质疏松症，雌激素、降钙素、骨钙素和维生素K，或大剂量的膳食钙均 用作干预治疗。其它的骨质疏松的治疗途径包括双磷酸酯、甲状旁腺激素、拟钙剂 (calcimimetic)、他汀类、镧和锁的盐以及氟化钠。然而，这些治疗方法通常与不良副作用 相关联。
[0011] 因此，本发明的目的是提供促进骨骼生长和矿化的组合物及方法。
【发明内容】
[0012] 发明概述
[0013] 部分地，本发明证明了具有激活素（activin)或激活素IIA型受体（ActRIIa) 拮抗剂活性（"activin拮抗剂"和"ActRIIa拮抗剂"）的分子能够用于增加骨骼密度， 促进骨骼生长，并且/或增加骨骼强度。特别地，本发明证明了ActRIIa的可溶形式作为 activin-ActRIIa信号的抑制剂，并且在体内促进增加的骨骼密度、骨骼生长和骨骼强度。 然而，绝大多数的促进骨骼生长或抑制骨骼损失的药物制剂或者作为抗-分解代谢制剂 (通常也涉及如"分解代谢制剂"）（如，双磷酸酯）或者作为合成代谢制剂（如，甲状旁腺 激素，PTH，当剂量适宜时），可溶性的ActRIIa蛋白显示双重活性，具有分解代谢和合成代 谢的效果。因此，本发明确立，activin-ActRIIa信号通路的拮抗剂可以用于增加骨骼密度 以及促进骨豁生长。然而可溶性的ActRIIa可能通过除了activin诘抗以外的机制影响骨 骼，尽管如此，本发明证明了合意的治疗剂可以根据activin-ActRIIa拮抗剂活性来选择。 因此，在某些实施方式中，本发明了提供了使用activin-ActRIIa拮抗剂的方法来治疗与 低骨骼密度或低骨骼强度相关联的疾病（如骨质疏松症）或促进有此需要的患者（如在骨 折的患者中）的骨骼生长，所述的activin-ActRIIa拮抗剂包括例如激活素结合IIA型受 体（activin-bindingActRIIa)多肽、抗activin抗体、抗ActRIIa抗体、activin革巴向或 ActRIIa革El向的小分子和核酸适体，以及降低activin和ActRIIa表达的核酸。此外，可溶 性的ActRIIa多肽促进骨骼生长而不造成肌肉质量的持续可测量的增加。
[0014] 在某些方面，本发明提供了包括可溶的、结合至activin的activin-binding ActRIIa多肽的多肽。ActRIIa多肽可以被制成包含activin-bindingActRIIa和药学 上可接受的载体的药物制剂。优选的，activin-bindingActRIIa多肽以小于1个微摩 尔或小于100、10或1个纳摩尔的Kd结合至激活素。视情况，相对于⑶Fll和/或⑶F8， activin-bindingActRIIa选择性地结合activin，优选地，activin的Kd至少比GDFll和 /或GDF8的Kd要低10倍、20倍或50倍。然而不希望束缚于特定的作用机制，预期的是， activin抑制高于GDF11/GDF8的选择度说明了在骨骼上的选择效果不会在肌肉上造成持 续可测量的效果。在一些实施方式中，选择引起低于15%、低于10%或低于5%的肌肉增 长的ActRIIa在骨骼上获得合意的效果的剂量。优选地，组合物的纯度至少是95%，有关 其它的多肽成分，通过尺排阻色谱确定，更优选地，组合物的纯度至少是98%。这样的制 剂中使用的activin-bindingActRIIa多肽可以是本发明所公开的任意多肽，如具有选自 SEQIDNos:2、3、7、12或13的氨基酸序列的多肽，或与选自SEQIDNos:2、3、7或12的氨 基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%同一性的多肽。八(^"111-1^11(111^ ActRIIa多肽可以包括天然的ActRIIa的功能性片段，如包含选自SEQIDNOs:1-3的序列 或SEQIDNos:2 (缺少C末端的10到15个氨基酸）的序列的至少10个、20个或30个氨 基酸（"尾"）。
[0015] 相对于天然存在的ActRIIa多肽，可溶性的、activin-bindingActRIIa多肽可以 包括一个或多个氨基酸序列的改变（例如在配体结合结构域）。改变了的ActRIIa多肽的 例子提供在WO2006/012627的第59-60页，在此以引用的方式并入本文。氨基酸序列的改 变可以是，例如，当在哺乳动物、昆虫或其它真核细胞生产时改变多肽的糖基化，或者相对 于天然存在的ActRIIa多肽改变多肽的蛋白酶切。
[0016] Activin-bindingActRIIa多肽可以是融合蛋白，其具有ActRIIa多肽的一个结 构域（例如ActRIIa多肽的配体结合部分）和一个或多个另外的提供合意的特性（如改 进的药代动力学、更容易纯化、靶向特定的组织等）的结构域。例如，融合蛋白的结构域可 以增强体内稳定性、体内半衰期、吸收/施用、组织定位或分配、蛋白质复合物的形成、融合 蛋白的多聚化和/或纯化中的一种或多种。Activin-bindingActRIIa融合蛋白可以包括 免疫球蛋白Fc结构域（野生型或突变体）或血清白蛋白或其它提供合意特性（诸如改进 的药代动力学、改进的可溶性或改进的稳定性）的多肽部分。在一个优选的实施方式中， ActRIIa-Fc融合包括相对非结构化连接子，其位于Fc结构域和ActRIIa胞外结构域之间。 这种非结构化的列键字可以对应于ActRIIa胞外结构域的C末端端点（"尾"）的大致15 个氨基酸非结构化区域，或者其可以是1、2、3、4或5个氨基酸的人工序列，或5个与15、20、 30、50个或更多个二级结构相对自由的氨基酸间的长度，或两者的混合物。连接子可以是富 含甘氨酸和脯氨酸残基的，并且可以，例如，含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的简单序列或苏 氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列（例如，TG4SSG4单态或重复序列）。融合蛋白可以包 括纯化的子序列，如表位标签、FLAG标签、多聚组氨酸序列以及GST融合。视情况，可溶性的 激活素结合IIA型受体多肽包括一个或多个选自下组的修饰的氨基酸残基：糖基化的氨基 酸、聚乙二醇修饰的（PEGylated)氨基酸、法尼基化（farnesylated)的氨基酸、乙酰化的氨 基酸、生物素化的氨基酸、耦联脂质体部分的氨基酸、耦联有机衍生物制剂的氨基酸。药物 制剂也可以包括一个或多个附加化合物诸如用于治疗骨骼疾病的化合物。优选地，药物制 剂大体上是无致热源的。一般地，优选的是ActRIIa蛋白在哺乳动物细胞系中表达，所述的 细胞系调节ActRIIa蛋白合适地天然糖基化以消除患者的不良免疫反应的可能性。人细胞 系以及CHO细胞系已被成功地应用，并且预期其它普通的哺乳动物表达系统也是有用的。
[0017] 如本发明所描述的，ActRIIa蛋白指定的ActRIIa-Fc具有合意的特性，包括相对 于GDF8和/或GDFll选择性地结合激活素，配体结合的高亲和性以及动物模型中大于两周 的血清半衰期。在某些实施方案中，本发明提供了ActRIIa-Fc多肽以及包含这样的多肽和 药学上可接受的赋形剂的药物制剂。
[0018] 在某些方面，本发明提供了编码可溶性activin-bindingActRIIa多肽的核酸。 分离的多核苷酸可以包含诸如上面所描述的可溶性activin-bindingActRIIa多肽的编码 序列。例如，分离的核酸可以包括ActRIIa的胞外结构域（例如，配体结合结构域）的编码 序列，以及编码部分或全部的跨膜结构域和/或ActRIIa的胞浆结构域的序列，但不编码位 于跨膜结构域中或胞浆结构域中的或位于胞外结构域与跨膜结构域或胞浆结构域之间的 终止密码子。例如，分离的多核苷酸可以包含全长ActRIIa多核苷酸序列诸如SEQIDNO: 4或5,或部分截除的序列，所述的多核苷酸进一步包含在3'末端之前至少600个核苷酸或 其它的使得多核苷酸的翻译导致胞外结构域随机地融合到部分截短的全长ActRIIa的位 置的转录终止密码子。优选的核酸序列是SEQIDNO:14。本发明所公开的核酸可操作地 连接到用于表达的启动子，并且本发明提供了转化了这样的重组多核苷酸的细胞。优选地， 所述的细胞是哺乳动物细胞，诸如CHO细胞。
[0019] 在某些方面，本发明提供了制备可溶性activin-bindingActRIIa多肽的方法。 这样的方法可包括在适宜的细胞（诸如中国仓鼠卵巢（CHO)细胞）中表达本发明所公开的 任何核酸（例如，SEQIDNO:4、5或14)。这样的方法可包括：a)在适宜的条件下培养细胞 以表达可溶性的ActRIIa多肽，其中所述的细胞转化有可溶性ActRIIa的表达构建物；以及 b)复性所表达的可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRIIa多肽可以作为天然的、部分纯化的 或高度纯化的片段复性。纯化可以通过一系列的纯化步骤完成，包括例如，下面所述中的一 个、两个或三个或多个，以任意的顺序：蛋白亲和层析（proteinAchromatography)、阴离 子交换层析（例如，Q琼脂糖）、疏水层析（例如，苯基琼脂糖），尺寸排阻层析和阳离子交 换层析。
[0020] 在某些方面，本发明所公开的activin-ActRIIa诘抗剂，诸如可溶性的 activin-bindingActRIIa多肽，可以用于一种以促进骨豁生长或增加骨豁密度为目 的的方法。在某些实施方式中，本发明提供了治疗低骨骼密度相关疾病或在有此需求 的患者中促进骨骼生长的方法。该方法可以包含对有此需求的对象施用有效剂量的 activin-ActRIIa诘抗剂。在某些方面，本发明提供了使用activin-ActRIIa诘抗剂制备治 疗上面所述的疾病或状况的药物。
[0021] 在某些方面，本发明提供了鉴别刺激骨骼生长或增加骨骼矿化的药物的方法。所 述的方法包括：a)鉴别结合至activin或ActRIIa多肽的配体结合结构域的待测药物I;b) 评估药物在骨骼生长或矿化上的效果。
【附图说明】
[0022] 图1显示了CHO细胞中所表达的ActRIIa-hFc的纯化。纯化的蛋白为一个良好峰 形的单峰。
[0023] 图 2 显不了ActRIIa-hFc结合至activin和GDFll，通过BiaCore分析检测。
[0024] 图3显示了A-204报告基因分析的示意图。该图显示了报告载体： pGL3 (CAGA) 12 (在EMBO17 :3091-3100 中有描述，Dennler等，1998)。CAGA12 基序出现在 TGF-Beta反应性基因（PAI-1基因）中，因此该载体通常用于通过Smad2和3信号通路的 因子。
[0025] 图4显示了A-204报告基因分析中ActRIIa-hFc(菱形）和ActRIIa-mFc(方块） 在GDF-8信号上的效果。两种蛋白都展示了其在皮摩尔浓度几乎完全抑制GDF-8调节的信 号。
[0026] 图5显示了A-204报告基因分析中三种不同的ActRIIa-hFc制剂在⑶F-Il信号 上的效果。
[0027] 图6显示了对照组和ActRIIa-mFc处理的BALB/c小鼠在12周的治疗期前（上 面）和后（下面）的DEXA(双能X线吸收测定）图像的示例。浅色部分显示了增加了的骨 骼密度。
[0028] 图7显示了ActRIIa-mFc在BALB/c小鼠12周治疗期间对骨矿密度的效果 的定量。治疗分为对照（菱形）、2mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(方块）、6mg/kg剂量的 ActRIIa-mFc(三角形）以及 10mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(圆圈）。
[0029] 图8显示了ActRIIa-mFc在BALB/c小鼠12周治疗期间对骨矿含量的效果 的定量。治疗分为对照（菱形）、2mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(方块）、6mg/kg剂量的 ActRIIa-mFc(三角形）以及 10mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(圆圈）。
[0030] 图9显示了ActRIIa-mFc对摘除卵巢（OVX)或假手术6周以上的C57BL6小鼠松质 骨骨矿密度的效果的定量。治疗分为对照（PBS)或10mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(ActRIIa)。
[0031] 图10显示了ActRIIa-mFc在摘除卵巢的（0VX)C57BL6小鼠的12周治疗期间对松 质骨的效果的定量。治疗分为对照（PBS，浅色条）或10mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(ActRIIa， 深色条）。
[0032] 图11显示了ActRIIa-mFc在假手术的C57BL6小鼠6周或12周治疗期后对松质 骨的效果的定量。治疗分为对照（PBS，浅色条）或10mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(ActRIIa， 深色条）。
[0033] 图12显示了摘除卵巢的（OVX)小鼠的12周治疗期间的骨骼密度pQCT分析结果。 治疗分为对照（PBS，浅色条）或10mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(ActRIIa，深色条）。Y轴：mg/ ccm
[0034] 图13描述了假手术的小鼠12周治疗期间的骨骼密度pQCT分析结果。治疗分为 对照（PBS，浅色条）或 10mg/kg剂量的ActRIIa-mFc(ActRIIa，深色条）。Y轴：mg/ccm
[0035] 图14A和图14B显示了 12周治疗期后（A)的全身DEXA分析和股骨间接体内分析 (B)。亮区描述了高骨骼密度的区域。
[0036] 图15显示了 12周治疗期后的股骨中段的间接体内pQCT分析。治疗分为对照 (PBS，深色条）和ActRIIa-mFc(浅色条）。左侧的四个条显示总骨骼密度而右侧的四个条 显示皮质骨密度。每四个条的第一对代表了源于摘除卵巢的小鼠的数据而第二对代表了源 于假手术小鼠的数据。
[0037] 图16显示了 12周治疗期后的股骨中段的间接体内pQCT分析和骨干含量。治疗 分为载体对照（PBS，深色条）或ActRIIa-mFc(浅色条）。左侧的四个条显示总骨骼含量而 右侧四个条显示皮质骨含量。每四个条的第一对代表了源于摘除卵巢的小鼠的数据而第二 对代表了源于假手术小鼠的数据。
[0038] 图17显示了股骨中段的间接体内pQCT分析和股骨皮层厚度。治疗分为对照（PBS， 深色条）或ActRIIa-mFC(浅色条）。左侧的四个条显示骨内膜周长而右侧的四个条小时骨 膜周长。每四个条的第一对代表了源于摘除卵巢的小鼠的数据而第二对代表了源于假手术 小鼠的数据。
[0039] 图18描述了 12周治疗期后的股骨力学检测结果。治疗分为对照（PBS，深色条） 或ActRIIa-mFC(浅色条）。左侧的两个条代表了源于摘除卵巢的小鼠的数据而后面的两个 条代表了源于假手术小鼠的数据。
[0040] 图19显示了ActRIIa-mFc对松质骨容积的影响。
[0041] 图20显示了ActRIIa-mFc对股骨远端的松质骨结构的影响。
[0042] 图21显示了ActRIIa-mFc对皮质骨的影响。
[0043] 图22显示了ActRIIa-mFc对骨骼力学强度的影响。
[0044] 图23显示了在三个不同剂量下，不同剂量的ActRIIa-mFc对骨骼特性的影响。
[0045] 图24显示了组织形态学测量（histomorphometry)表明ActRIIa-mFc具有双重的 合成代谢和抗吸收活性。
[0046] 发明详述
[0047] 1.综述
[0048] 转化生长因子beta(TGF-beta)超家族包含多种具有相同的共有序列单元以及结 构基序的生长因子。已知这些蛋白对脊椎动物和无脊椎动物的许多类型的细胞发挥生物学 功能。超家族的成员在胚胎发育期的模式形成以及组织分化中执行重要功能，并且能影响 多种分化进程，包括脂肪生成、肌肉发生、软骨形成、