富含二十碳五烯酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法
【技术领域】
[0002] 本发明设及食品加工中油脂加工领域，特别地，本发明设及一种微生物功能性油 脂提取方法。
【背景技术】
[0003] 拟微球藻sp.)是一种黄绿色单细胞超微型藻，其富含蛋白质、 多种氨基酸、矿物质等，脂含量占自身干重的38%左右，营养价值高，已成功进行大规模培 育。目前针对拟微球藻的研究集中在W下几个方面：拟微球藻中二十碳五締酸的提取及富 集；生长环境对拟微球藻生长和油脂积累的影响的研究等。拟微球藻的一个重要特点是其 脂肪酸组成中EPA含量较高，是工业化提取EPA的理想原料。拟微球藻的市场应用多W动 物饲料为主。而W拟微球藻为原料，生产富含EPA的食用型油脂鲜见报道。
[0004] 二十碳五締酸（Eicosapentaenoicacid，EPA)属于n-3多不饱和脂肪酸，是大脑、 神经和视觉细胞中重要的脂肪酸成分，对人体生理功能的正常发挥及多种疾病的防治有着 重要作有着重要作用，如预防屯、血管疾病，抗癌、抗炎、抑制过敏反应和增强免疫力等。长期 W来，EPA和同属于n-3多不饱和脂肪酸的二十二碳五締酸（Docos址exaenoicacid,DHA) 主要来源于寒冷地区（南极和北极）深海鱼中提取的深海鱼油。但渔业资源可能减少，而人 类对EPA和DHA需求量的增加，通过人工养殖微藻并提取n-3多不饱和脂肪酸已成为国际 上新的n-3多不饱和脂肪酸来源。
[0005] 微藻油油脂提取的工艺并不复杂，根据油脂的相似相容原理选择适当的溶剂进行 提取。通常所选择的溶剂毒性较大，例如乙二醇二甲酸、甲醇、乙酸、丙=醇等有机溶剂。运 对工业化生产食用型藻油或是EPA产品是不利的，如：一种从布朗葡萄藻湿藻体中提取藻 油的方法（申请号201110029756. 5)，微藻油脂的提取方法（申请号201010607927. 3)，一种 微藻油脂提取方法（申请号201210511744. 0)。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一种富含二十碳五締酸拟微球藻油脂超声波辅助溶 剂提取方法。
[0007] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的。
[0008] -种富含二十碳五締酸拟微球藻油脂超声波辅助溶剂提取方法，包括W下步骤： (1) 将破壁拟微球藻粉和提取溶剂混合； (2) 在水浴条件下超声浸提； (3) 超声结束后将料液分离； (4) 分离后的固体部分进行重新浸提或不进行重新浸提； (5 )分离后的液体部分进行溶剂回收即可得到藻油。
[0009] 所述步骤（1)中的提取溶剂为体积比90%乙醇，料液比为1:15 (g/mL)。
[0010] 所述步骤（2)中水浴的溫度为50°C，超声时间为30min。
[0011] 所述步骤（3)所述的料液分离采用离屯、或者抽滤。
[0012] 所述步骤（3)离屯、转速为3000;r/min。
[0013] 所述步骤（4)中所述重新浸提的次数为两次，总提取次数为=次。
[0014] 所述步骤（5)中所述溶剂回收采用旋转蒸发的方法，并且回收的乙醇可W重复利 用。
[0015] 所述步骤（5)中藻油的提取率> 37%。
[0016] 进一步，所述步骤（5)取得到的藻油进行气相色谱检测，测定其中主要脂肪酸组 成，记录主要的检测数据。
[0017] 所述步骤（5 )中藻油中含有的主要脂肪酸有肉豆違酸、栋桐酸、栋桐油酸、油酸、亚 油酸、花生四締酸、二十碳五締酸（EPA)，其中EPA占总脂肪酸的质量百分比例> 39%。
[0018] 本发明的有益效果是： (1) 本发明采用大规模工业生产易行的方法，高效地对富含EPA的微拟球藻油脂进行 提取； (2) 提取溶剂乙功醇为低毒性提取剂，可作为生产微藻食用油的安全溶剂； (3) 本发明提取出的藻油经过气相色谱仪检测，EPA的含量占总脂肪酸的39%，可作为 工业生产EPA的原料。
【附图说明】
[0019] 下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明范围。
[0020] 图1是本发明的一种提取工艺流程； 图2是工艺优化中不同种类溶剂对提取率的影响； 图3是工艺优化中不同浓度乙醇对提取率的影响； 图4是工艺优化中超声浸提溫度对提取率的影响； 图5是工艺优化中超声浸提时间对提取率的影响； 图6是工艺优化中料液比对提取率的影响； 图7是工艺优化中提取次数对提取率的影响； 图8是藻油的气相色谱图。
【具体实施方式】
[0021] 本发明的一种提取工艺流程如图1所示，称取一定量的破壁微拟球藻粉，按1:15 (g/血)的料液比加入90%乙醇溶液，充分混匀，在水浴溫度为50 °C的超声设备中超声浸提 30min。超声浸提结束后在3000r/min转速下离屯、5分钟或者进行抽滤处理，离屯、（或抽 滤）后将上清液与沉淀分离。其中沉淀部分需回收进行2次提取，总提取次数为3次，取上 清液部分进行旋转蒸发回收乙醇后即得到藻油。对提取的藻油W及原料藻粉进行气相色谱 检测。检测步骤如下： 1、肪酸采用=氣化棚法甲醋化：取2yL油脂加入=氣化棚甲醇溶液和正己烧各1. 5 血，充入氮气，密封。在干式加热器中100°C条件下加热60min,冷却至室溫。加入1血双 蒸水，摇匀1min, 3000r/min条件下离屯、5分钟，将上层己烧相移到一个干净的试管中， 加入无水硫酸钢除去水分，移取溶液至干净试管，溶液用硅胶柱过滤。在氮气环境中吹干该 过滤液，加入100yL己烧再溶解。
[0022] 2、气相色谱分析：用GC-14C型气相色谱仪测定脂肪酸，用N2010色谱数据工作站 采集图谱，并处理分析所采集的谱图数据。色谱峰采用混合的脂肪酸甲醋标样来进行鉴定。 定量方式采用面积法，定量方法为归一法。
[0023] 3、谱图采集处理：采用与标准品保留时间对照的方法定性，即根据相对保留值定 性；采用面积法定量，即运用面积归一法求各色谱峰面积，并计算样品中的脂肪酸含量。
[0024]4、气相色谱分析条件：调节空气到50,调节氨气到75,调节Col(柱溫)到140°C， 调节Det(检测器溫度）到270 °C，调节Aux(进样口溫度）到270 °C。柱溫升溫程序：140 °C(1min)；6°C/minUTO°C(3min)；9°C/min^220°C(18min)；2°C/min^230°C (2min)。
[00巧]实施例一：EPA藻油提取工艺优化单因素试验1、溶剂对微藻油提取率的影响 在料液比为1:10、提取30min,浸提溫度45 °C的条件下，考察不同溶剂对微藻油提取 率的影响。结果（图2)表明，W乙醇作为提取溶剂的提取率，明显高于W正己烧和石油酸为 提取溶剂的提取率。同样用乙醇作为提取剂，则用95%的乙醇的提取率高于75%的乙醇。
[0026] 2、乙醇浓度对微藻油提取率的影响 由于油脂的脂溶性特点，作为提取溶剂的乙醇浓度不宜过低，否则产物中水溶性产物 较多不利于油脂提取。因此试验选取浓度在60%W上的乙醇为溶剂。W5%浓度为梯度，从 60%浓度到95%浓度共设定8个组，料液比1 : 10(g/mL)，提取时间为30min,超声辅助浸 提溫度为45 °C。图3显示，当乙醇浓度在60%至90%时，提取率呈逐步上升趋势；当乙醇 浓度为90%时提取率达到最大值，之后随乙醇浓度的进一步提高，提取率呈现下降趋势。因 此