高效降解仲丁灵的蜡状芽孢杆菌ly05及其应用及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物技术领域，尤其是一种高效降解仲下灵的蜡状芽抱杆菌LY05 及其应用及使用方法。
【背景技术】
[0002] 仲下灵（Butralin)化学名称为N-仲下基-4-特下基-2,6-二硝基苯胺，又名止 芽素，基本理化性质如式1所示。仲下灵属于二硝基苯胺类除草剂，可被杂草根系或芽銷吸 收，药剂进入植物体后，主要抑制分生组织的细胞分裂，从而抑制杂草幼芽及幼根生长，可 用于棉花、大豆、魏豆、油菜、花生、上豆、冬小麦、大麦、藍麻、向日葵、甘薦、蔬菜、果树等，主 要用于防除单子叶杂草和一年生阔叶杂草，也可防除小粒种子的双子叶杂草。亦可作植物 生长调节剂使用，控制烟草蔽芽生长。
[0003] 随着仲下灵使用的日益广泛和使用时间的延长，加之耐光、热的特点，其在±壤中 的持效期较长，使用不当会对后巷作物产生药害，如果残留超过最大限量，则会对人畜产生 不良影响或通过食物链对生态系统中的生物造成毒害。因此，消除环境中仲下灵的残留污 染引起科研工作者的高度重视，已成为一个重要的研究课题。
[0004] 生物修复度ioremediation)技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点，已 成为处理环境中有机污染物的有效措施。国际上已有利用生物修复技术成功治理石油污染 的先例。近年来，研究利用生物修复技术治理农药残留污染已成为研究热点。目前许多发达 国家和大公司都投入巨资W从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国BCI公司、 美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展 有限公司已成功生产"比亚"生物降解制剂可用于去除有机憐类农药残留。但是，由于农药 结构多样性，而微生物降解农药往往具有很强的针对性，导致现有降解菌资源库远不能满 足农药残留污染生物修复的实际需求。目前还没有专口针对仲下灵的降解微生物及其相关 降解制剂产品。因此，有针对性地筛选高效降解菌株，研制微生物修复剂，通过人工接种加 速±壤中除草剂的降解，消除残留药害是一项十分必要的工作和切实可行的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是：提供一种高效降解仲下灵的蜡状芽抱杆菌LY05。
[0006] 本发明的另一目的是提供该菌株在降解仲下灵农药残留中的应用。
[0007] 本发明的另一目的是提供所述菌株在制备降解仲下灵制剂中的应用。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种降解仲下灵的制剂。
[0009] 本发明是运样实现的：高效降解仲下灵的蜡状芽抱杆菌LY05,其保藏号为CCTCC NO:M2015397。
[0010] 该菌株16SrDNA序列如沈QIDNO. 1所示。
[0011] 高效降解仲下灵的蜡状芽抱杆菌LY05的菌株在降解仲下灵农药残留中的应用。
[0012] 采用高效降解仲下灵的蜡状芽抱杆菌LY05的菌株生产降解仲下灵制剂的方法， 包括如下步骤： 1) 将蜡状芽抱杆菌LY05的菌株于无机盐培养基中，30~35°C，150~200巧m下振荡 培养至对数生长期，获得菌种. 2) 将上述菌种按无机盐培养基的体积比的10%的接种量接种入种子瓶，30~35°C， 150~200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液； 3) 将获得的种子液按照10%的体积比的接种量接种入发酵培养基中，在30~35°C、 150~200rpm下发酵培养45-5化，获得发酵液，发酵液的菌数大于3.OX10?C化/mU将发 酵液直接稀释5-20倍作为液体菌剂。
[0013] 在种子发酵罐和生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0. 40~0. 60mV min,揽拌速度为150~200r/min，溫度30~35°C，种子罐的培养时间及生产发酵罐的培 养时间均为45-5化，发酵结束后菌体数量大于3. 0X1〇9C化/mL。
[0014] 步骤2)中所述的发酵培养基与步骤3)中所述的发酵培养基相同，其组成按质量 百分比比计算，包括酵母膏0. 5%，蛋白腺1%，葡萄糖0. 5%，化C1 1%，其余为水，pH7。
[001引步骤1)及步骤2)中所述的无机盐培养基，皿2?040. 4g，K2HPO40. 4g，NH4CI1g，MgCl20. 1g，Na2S041.425g，FeS04.7H20 0.025g，微量元素液 10 血，加蒸馈水定容至 1100血，pH7. 0,高压蒸汽灭菌（12rC，20min);其中微量元素液组成如下：ZnS04.7H20 1. 1g，M拆O4?H2O0. 58g，（NH4)sM07024? 4&0 0. 18g，C0SO4? 7&0 0. 024g，C11SO4? 5&0 0. 077g，H3BO30. 029g，NaN03? 4&0 0. 074g，蒸馈水 1L。
[0016] 一株降解仲下灵的蜡状芽抱杆菌cereus)LY05,所述菌种保存在 中国典型培养物保藏中屯、（CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCN0:M 2015397,保藏日期为2015年6月19日。
[0017] 所述菌株经形态学特征、生理生化特性、16SrDNA序列分析鉴定为蜡状芽抱杆菌 (《acinuscereus)，该菌株在在牛肉膏蛋白腺固体平板上生长很快，呈圆形或近似圆形、 质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状，成短或长链，芽抱中生，无芙膜。电 子显微镜下观察杆状细胞长直径〉1 y m。通过生理生化特性测定，显示该菌株革兰氏阳性， 接触酶阳性，氧化酶阴性，VP试验阳性，甲基红试验阳性。该菌可利用葡萄糖、巧樣酸盐；不 利用木糖、k阿拉伯糖、甘露醇。
[0018] 本发明筛选获得一株蜡状芽抱杆菌化？cereus)LY05,该菌株可在短时间 内有效降解仲下灵农药残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成本低，去除率达到 80%W上，可用于修复仲下灵污染的水体、±壤等自然环境，解决农业生产中农药残留超标 问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。使用蜡状蜡状芽抱杆菌LY05生产制备得 到的液体菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理水体和±壤等环 境中仲下灵造成的污染，具有非常重要的理论和应用价值。
【附图说明】
[0019] 附图1为仲下灵标准品色谱图； 附图2为降解菌剂对无机盐培养基中仲下灵（50mg/L)的降解率； 附图3为降解菌剂对±壤中仲下灵（50mg/L)的降解率。
【具体实施方式】
[0020] 本发明的实施例1 :仲下灵降解菌LY05的分离与鉴定 1)仲下灵降解菌LY05的分离与筛选 称取长期受仲下灵污染上壤10g于250mLS角锥形瓶中，加入100mL无机盐培养 基，添加仲下灵至浓度为100mg/l，=角锥形瓶置于摇床（30°C，200巧m的上培养7d，取5 mL培养液接种至新鲜基础培养基(仲下灵100mg/L)中，然后在30°C摇瓶培养7d，依次类 推，按仲下灵100mg/L的浓度梯度增长，使最终富集培养液仲下灵的浓度达到1000mg/l， 得到富集降解菌株。
[0021] 降解菌富集分离过程中，每2次转接后，将菌悬液制备成102~106系列稀释液， 用涂布法分别在固体分离纯化培养基上进行分离，28°C培养两天，根据其不同的外观形态 和特征挑取单菌落，反复划线纯化，并根据菌落外观形态特征和显微形态观察的菌体形态 特征合并相同的菌株，并将所得的菌株接种于固体分离纯化培养基斜面，保存、备用。
[0022] 经过大量的富集培养，分离到能够在含仲下灵1000mg/L的分离培养基上生长的 菌株20余株，并使用高效液相色谱法0PLC)验证其降解效果。进一步筛选后，获得一个编 号为LY05的菌株，命名为降解菌LY05,该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度50. 0mg/L 的仲下灵在7d内降解85%W上。
[002引HPLC测定条件：Waters600E高效液相色谱仪（美国Waters);检测器：Waters2487 紫外检测器（美国Waters);色谱柱：Cis反相柱（SunFire?, 150nmX4. 60 mm, 5ym);流动相为乙腊：水（80 : 20,V/V),流速1. 2血/min;柱溫35°C;检测波长： 240nm;进样量：5jiL。在上述条件下，仲下灵的峰形由一个峰组成，且峰尖锐、稳定，保留 时间约为13. 1min(见图1)。
[0024] 2)仲下灵降解菌LY05的鉴定 (1)降解菌LY05的形态学鉴定将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离 并纯化得到的降解菌LY05进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润 度、菌落表面状态、菌落边缘状态。对于处于对数生长期的所述降解菌LY05,经涂片染色后 采用光学显微镜观察菌体的形态。
[00巧]结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的降解菌LY05在牛肉膏蛋白腺固体平板 上生长很快，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的白色菌落，生长较快。菌体细胞杆状， 成短或长链，芽抱中生，无芙膜。电子显微镜下观察杆状细胞长直径〉1ym。。
[0026] (2)生理生化特征分析 参考《微生物学实验》（沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验（第=版）.北京：高等 教育出版社，1999.)和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手 册.北京：科学出版社，2011.)测定降解菌LY05的生理生化特征。
法:叩'聚承氣薇黑顯攘，、心嗦添辰據凛擬煙
[0027] 测定结果显示，该菌株革兰氏反应阳性，接触酶反应阳性，氧化酶反应阴性。所述 降解菌LY05的生理生化特征测定结果如表2所示。
[0028] (3)仲下灵降解菌16SrDNA的同源性分析 DNA测序