检测脂肪肉瘤的小rna指纹图谱及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种小RNA(miRNA ;microRNA)指纹图谱在脂肪肉瘤诊断中的用途， 属于生物医学、生物工程和检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 脂肪肉瘤（LP巧是一种常见的恶性软组织肿瘤，起源于脂肪母细胞向脂肪细胞 分化的间叶细胞，故表现为不同分化程度的异型脂肪母细胞，均含有脂质。根据肿瘤细胞 的分化程度和类型可W分为五种亚型：分化良好型（WDLP巧、去分化型值DLP巧、黏液样型 (MLS)、圆形细胞型（RCL巧及多形性型（PLS)，但肿瘤中通常是多型细胞混合存在。从起源 来看，存在着脂肪组织的部位皆有可能发生脂肪肉瘤发生于肢体的病例占60%腹膜后间隙 占15%躯干部皮下15%，原发于肝脏的脂肪肉瘤极为罕见，至今所报道的肝脏原发性脂肪 肉瘤尚未超过10例。分化良好型和去分化型位于人类染色体12q，此位置还包括MDM2和 CDK4在内。
[0003] 手术治疗是脂肪肉瘤治疗中的第一选择。局部的广泛切除，是减少复发、转移的有 效措施。因为脂肪肉瘤淋己结转移罕见，引流区淋己结清扫多无必要。有文献报道除粘液 型和圆形细胞型脂肪肉瘤对放射治疗较敏感，但是，总体来讲放射治疗不是治疗脂肪肉瘤 的主要手段，多用于肿瘤边缘切除的病人，防止局部复发，对于局部能行根治性切除或广泛 切除的病人，术后放疗意义不大。由于高分化脂肪肉瘤恶性度低，转移的可能性小，化疗意 义不大。对于恶性度较高的类型为术后防止转移，可W行化疗。由于现在尚无对脂肪肉瘤 特效的化疗药物，目前多采用联合化疗，常用的药物有阿霉素ADM、顺销DDP、环憐酷胺CTX、 长春新碱VCR对于发现临床转移W前的微小转移灶有治疗意义。
[0004] 就脂肪肉瘤的诊断方法而言，最终要靠病理学的诊断，需要与恶性纤维组织细胞 瘤中的普通型和粘液型W及横纹肌肉瘤中的多形性型鉴别开来。因此临床上迫切需要为脂 肪肉瘤开发新的生物标示物，W进行准确的诊断和/或祀向治疗。
[0005] miRNA现已成为研究RNA的一大热点，其表达水平和肿瘤细胞的分化程度密切相 关。其在转录后水平调控祀基因表达，具有广泛的基因调节功能，可调苄基因活动各个层 面，如生长、分化、调亡等。最近，有文献报道和LPS有关的miRNAs包括有miR-143扣gras S 等人；2011)，miR-155 狂hang P 等人；2012)，和 miR-486 度ajou K 等人，2004;Borjigin N 等人，2012)等。
[0006] 尽管目前已有部分关于脂肪肉瘤诊断和治疗的研究，在临床上脂肪肉瘤仍然很难 准确诊断并得到有效治疗，患者中观测到的死亡率表明疾病的诊断、治疗和预防仍需要改 进。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供有效的小RNA指纹图谱，用于脂肪肉瘤诊断、肿瘤分级和 预后评价。
[0008] 本发明的第一方面，提供了一种分离的miRNA，所述的miRNA为：
[0009] (i)序列如沈Q IDNO:n所示的miRNA，其中n为选自1-21的正整数；
[0010] (ii)与沈Q ID N0:n所示序列互补的miRNA ;
[0011] (化）序列如SEQ ID NO: 1-21所示的miRNA中的两种或两种W上的组合；或
[001引 （iv )与SEQ ID NO: 1-21所示序列互补的miRNA中的两种或两种W上的组合。
[0013] 本发明的第二方面，提供了一种miRNA集合或组合，所述miRNA集合或组合包含序 列如沈Q ID NO: 1-2所示的2种miRNA。
[0014] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合还包含序列如SEQ ID N0:3所示的 miRNA。
[0015] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合还包含选自SEQIDNO: 4-9所示序列中 的至少2种miRNA。
[0016] 在另一优选例中，所述的miRNA分离自人。
[0017] 在另一优选例中，所述的序列可通过化学合成或构建真核细胞表达载体进行表达 获得。
[0018] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合包含序列如SEQIDN0:l-7、9-ll所示的 10种miRNA ;或者
[0019] 所述miRNA集合或组合包含序列如沈Q ID NO: 1-5、9、12-15所示的10种miRNA ; 或者
[0020] 所述miRNA集合或组合包含序列如沈Q ID NO: 1-4、6、8、16所示的7种miRNA;或 者
[002。 所述miRNA集合或组合包含序列如沈Q ID NO: 1、2、8、17-21所示的8种miRNA。
[0022] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由十个miRNAs组成的小RNA指纹图 谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；
[0023]所述十个 miRNAs 为 hsa-miR-493#, hsa-miR-145, hsa-miR-486-5。，hsa-miR -329, hsa-miR-130b,hsa-miR-369-3p, hsa-miR-144#, hsa-miR-381, hsa-miR-376b 和 hsa-miR-496。
[0024] 在另一优选例中，所述十个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂肪 肉瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2,其中5种在脂肪肉瘤组织组织中上调 化sa-miR-493#，hsa-miR-26a_2#, hsa-miR-329, hsa-miR-369-化和 hsa-miR-49f5) ;5 种在 脂肪肉瘤组织中下调化sa-miR-486-5p, hsa-miR-486-化，hsa-miR-144#, hsa-miR-195 和 hsa-miR-145);由此从脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织。
[0025] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由十个miRNAs组成的小RNA指纹图 谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或用于从正常脂肪组织中区分出 脂肪肉瘤组织；
[0026]所述十个 miRNAs 为 hsa-miR-493#，hsa-miR-369-3。，hsa-miR- 329, hsa-mi R-130b, hsa-miR-381, hsa-miR-376b, hsa-miR-496, hsa-miR-145, hsa-miR-486-5p 和 hsa-miR-144#。
[0027] 在另一优选例中，所述十个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂 肪肉瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2,其中7种上调化sa-miR-493#， hsa-miR-369-3p，hsa-miR-329, hsa-miR-130b, hsa-miR-381,hsa-miR-376b,和 hsa-miR-496) ;3 种下调化sa-miR-145, hsa-miR-486-5p 和 hsa-miR-144#);由此区分脂肪 肉瘤组织和正常脂肪组织。
[0028] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由屯个miRNAs组成的小RNA指纹图 谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或从瘤旁脂肪组织中区分出脂肪 肉瘤组织；
[0029]所述屯个 miRNAs 为 hsa-miR-SGa-2#，hsa-miR-486-5。，hsa-miR- 486-化，hsa-miR -144#，hsa-miR-4732-3p, hsa-miR-451和 hsa-miR-145。
[0030] 在另一优选例中，所述屯个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂肪肉 瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2,其中1种上调化sa-miR-26a-2#) ;6种下 调化sa-miR-486_5p, hsa-miR-486-化，hsa-miR-144#, hsa-miR-4732-3p, hsa-miR-451 和 hsa-miR-145);由此区分脂肪肉瘤组织和瘤旁脂肪组织。
[0031] 在另一优选例中，所述miRNA集合或组合为由八个miRNAs组成的小RNA指纹图 谱，用于脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；和/或用于脂肪肉瘤组织的分型（如 用于区分去分化型脂肪肉瘤组织与分化良好型脂肪肉瘤组织）；
[0032]所述八个 miRNAs 为 hsa-miR-144#，hsa-miR-45l，hsa-miR-2%- 2#，hsa-miR-365， hsa-miR-29b, hsa-miR-499-5p, hsa-miR-486-5p 和 hsa-miR-55化。
[0033] 在另一优选例中，所述八个miRNAs组成的小RNA指纹图谱中，各miRNA在脂肪肉 瘤组织和正常脂肪组织中表达倍数差异大于2,且均在去分化型脂肪肉瘤组织中下调化sa -miR-144#, hsa-miR-451, hsa-miR-29b-2#, hsa-miR-365, hsa-miR-29b, hsa-miR-499-5p, h sa-miR-486-5p和hsa-miR-55化）；由此区分去分化型脂肪肉瘤组织和分化良好型脂肪肉 瘤组织。
[0034] 本发明的第=方面，提供了一种分离的或人工构建的前体miRNA,所述的前体 miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第一方面所述的miRNA。
[0035] 本发明还提供一种分离的或人工构建的前体miRNA集合或组合，所述的前体 miRNA集合或组合中的前体miRNA能在人细胞内剪切并表达成本发明第二方面所述的 miRNA集合或组合中的miRNA。
[0036] 本发明的第四方面，提供了一种分离的多核巧酸，所述的多核巧酸能被人细胞转 录成前体miRNA,所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达成本发明第一方面所述的 miRNA ；
[0037] 较佳地，所述的多核巧酸具有式I所示的结构：
[0038] Seq 正向-X-Seq 反向 式 I，
[0039]式 I 中，
[0040] Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核巧酸序列，
[0041] Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核巧酸序列；
[004引X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和 Seq反向不互补，
[0043] 并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
[0044]
[004引式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
[0046] II表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
[0047] 本发明还提供一种分离的多核巧酸集合或组合，所述的多核巧酸集合或组合包括 能被人细胞转录成前体miRNA的多核巧酸，所述的前体miRNA能在人细胞内被剪切且表达 成本发明第二方面所述的miRNA集合或组合。
[0048] 在另一优选例中，所述的多核巧酸集合或组合中的一种或多种多核巧酸具有式I 所示的结构：
[0049]Seq 正向-X-Seq 反向 式 I，
[0050]式 I 中，
[0051] Seq正向为能在人细胞中表达成所述的miRNA的核巧酸序列，
[0052] Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核巧酸序列；
[005引 X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和 Seq反向不互补，
[0054]并且式I所示的结构在转入人细胞后，形成式II所示的二级结构：
[00 巧]
[0056] 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，
[0057] II表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。
[0058] 本发明的第五方面，提供了一种载体，它含有本发明第一方面所述的分离的 miRNA、或本发明第二方面所述的miRNA集合或组合，或本发明第四方面的多核巧酸。
[0059] 本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的分离的miRNA、或本发明第二方 面所述的miRNA集合或组合的用途，用于制备忍片或试剂盒；所述忍片或试剂盒用于：
[0060](1)脂肪肉瘤组织的诊断、肿瘤分级和预后评价；
[0061] (2)从正常脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；
[0062] (3)从瘤旁脂肪组织中区分出脂肪肉瘤组织；和/或
[0063] (4)区分去分化型脂肪肉瘤组织与分化良好型脂肪肉瘤组织。
[0064] 本发明的第屯方面，提供了一种miRN