一种桉树tps基因、rna干扰载体及应用

文档序号:9284935阅读:985来源:国知局
一种桉树tps基因、rna干扰载体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域,特别是设及一种按树TPS基因、用其构建的用于 按树遗传转化的降低化感作用的RNA干扰载体及在按树上的应用。
【背景技术】
[0002] 按树巧ucalyp化S)具有种类多、生长快、耐瘡薄、干形好、用途广的特点,是我国 华南各省区最重要和栽培面积最大的速生阔叶造林树种。然而,按树的大量引种栽植,也 带来了一些颇具争议的生态环境问题,如上壤退化、上地生产力下降、生物多样性减弱等。 其中,化感作用是按树人工材生态系统中颇受关注的生态现象,其表现形式是抑制其他植 物及林下植被甚至上壤中的微生物生长,导致林地群落结构简单、生物多样性减弱和生态 环境退化等现象,它对按树人工林群落的结构、功能、效益及发展均具有重大影响。
[0003] 目前国内外关于按树化感作用的研究已有不少的报道,取得的主要成果是按树化 感物质成分分析、化感物质的释放途径W及化感作用的生物测定等而有关按树化感物质 的生物合成途径和代谢调控机理等方面的研究尚未报道。研究表明,按树化感物质的主要 成分为a-松油醇(a-Te巧ineol)和按叶油素(l,8-Cineole)等祗类化合物。在其他已知 的一些生物中,祗类物质的生物合成主要由祗类合成酶(Te巧ene Synthase,TP巧家族催化 完成。首先,彼牛儿基焦憐酸盐(Geran^-PP,GP巧在TPS的催化下,生成a-松油醇,之后 a-松油醇进一步在TPS的催化下生成1,8-按叶油素;此外,彼牛儿基焦憐酸盐GPP在祗类 合成酶TPS的催化下还可W分别生成a-羡締(a-Pinene)和P -羡締(P -Pinene)。因此, 可W推测在按树化感物质的生物合成途径中,祗类合成酶(TP巧对a-松油醇和1,8-按叶 油素的形成有着重要的调控作用。
[0004] RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA (double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用 RNA干扰技术可W特异性剔除或关闭特定基因的表达,该技术已被广泛用于探索基因功能 和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。例如,毕海红在2008年利用RNA干扰技术,通过 转基因方式使水稻中A0S基因发生了沉默,由此降低了水稻的化感作用。Kazuaki等(2010) 利用紫苏(Perilla frutescens)中的巧樣締合成酶(limonene synthase, L巧基因对赤按 实生苗的下胚轴进行了转基因研究,结果表明转基因按树叶片中的巧樣締含量是野生型的 4~5倍。 阳〇化]但是,按树中a-松油醇和按叶油素的关键调控基因仍未见记载,更未有利用其构 建干扰载体应用到按树上降低按树的化感作用的记载,因此有必要在运个方向进行进一步 的研究。

【发明内容】
阳006] 本发明的目的是从按树中克隆出一条按树祗类合成酶(Te巧ene Synthase,说明 书及权利要求书中一般简称为TP巧基因的全长cDNA ;并构建相关的RNA干扰载体,此载体 包含WS基因的部分核巧酸序列;再用该干扰载体转化按树调节其a-松油醇和按叶油素的 合成,W降低按树的化感作用。
[0007] 为了实现上述发明目的,本发明的技术方案如下:
[0008] 本发明提供了一种按树WS基因,序列如SEQ ID N07,编码的蛋白质具有催化GPP 生成a-松油醇、W及进一步催化a-松油醇生成按叶油素的功能;并且GPP在TPS的催化下 还可W分别生成a-羡締(a-Pinene)和P -羡締(P -Pinene)。
[0009] 进一步地,上述按树TPS基因,是按如下步骤得到:(1) W多种植物的TPS基因的 保守功能区为模板,通过RT-PCR获得TPS基因的部分cDNA片段;(2)采用RACE技术,获得 TPS基因的5'端和3'端cDNA片段;(3)通过对序列的拼接和分析,获得TPS基因的全长 cDNA序列;(4)通过RT-PCR获得按树TPS基因的cDNA完整编码区片段。
[0010] 本发明再利用上述的按树TPS基因,构建一种用于降低按树化感作用的RNA干扰 载体,包括骨架载体和含有正向片段和反向片段的发夹结构,其特征在于,W所述TPS基因 的部分片段为正向片段或反向片段,所述TPS基因部分片段序列如SEQ ID N020。 W11] 所述发夹结构由如下方法得到:WpKANNIBAL为骨架载体,所述正向片段插入在 酶切位点化0 I和化n I之间,反向片段插入在酶切位点化nd III和甜a I之间,之后对 pKANNIBAkTPS-RNAi和PART27载体进行Not I单酶切和连接,即可得到按树低化感物质 RNA 干扰载体 pART27-TPS-RNAi。
[0012] 进一步地,所述用于降低按树化感作用的RNA干扰载体构建包括如下步骤:
[0013] (1)选取按树TPS基因的保守功能区作为RNA干扰片段,通过RT-PCR将化0 I 和化nl酶切位点加RNA干扰片段两端,作为正向片段;将化nd III和甜a I酶切位点加 在RNA干扰片段两端,作为反向片段;(2)将步骤(1)得到的正向片段和反向片段克隆至 pEASY-Blunt-Zero载体上,分别获得阳性质粒PEASY-TPS-P7和PEASY-TPS-P8 ; (3)将步骤 (2)得到的祀ASY-TPS-P7经化0 I和化n I双酶切后,与同样经过化0 I和化n I双酶切的 pKANNIBAL 载体连接,得到 pKANNIBAkTPS-P7 ; (4)将步骤(3)得到的 PEASY-TPS-P8 经 Hind III和甜a I双酶切后,与同样经过化nd III和甜a I双酶切的pKANNIBAkTPS-P7载体连 接,即可得到载体地ANNIBAkTPS-RNAi ; (5)将步骤(4)得到的pKANNIBAkTPS-RNAi经Not I单酶切后,与同样经过Not I酶切的PART27载体连接,即可得到载体pART27-TPS-RNAi。
[0014] 上述用于降低按树化感作用的RNA干扰载体在转基因植物中的应用,所述转基因 植物为按树。
[0015] 上述用于降低按树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应用,使受体的 化感作用降低,所述受体为赤按。
[0016] 进一步地,上述用于降低按树化感作用的RNA干扰载体转化有关受体植物的应 用,所述转化的方法为农杆菌介导法。
[0017] 进一步地,所述的农杆菌为根瘤农杆菌菌株EHA105。
[0018] 进一步地,所述赤按为种子萌发后的下胚轴。
[0019] 本发明采用祀ASY-TPS-P6质粒DNA为模板,根据TPS基因的保守区设计了引物 沈Q ID N021和沈Q ID N022为引物对,W及沈Q ID N023和沈Q ID N024为引物对,PCR 扩增得到TPS基因部分片段即TPS-P7和TPS-P8,将其分别作为正向片段和反向片段插入骨 架载体中得到本发明的干扰载体。将本发明的干扰载体转入受体植物中,将使TPS发生沉 默而不表达,从而降低了该受体植物的化感作用。
[0020] RNA干扰载体pART27-TPS-RNAi,适合于农杆菌介导转化按树,可获得低化感 作用的转基因后代,该载体携带有卡那霉素抗性筛选标记基因。采用的骨架载体是载 体pKANNIBAL和双元表达载体PART27,将TPS基因的正向片段插入在酶切位点化0 I 和化n I之间,将反向片段插入在酶切位点化nd III和甜a I之间,形成中间载体 pKANNIBAkTPS-RNAi,之后对 pKANNIBAkTPS-RNAi 和 PART27 进行 Notl 单酶切,将载体上 pKANNIBAkTPS-RNAi的元件插入到载体PART27中,形成最终干扰载体pART27-TPS-RNAi, 运样可用于农杆菌介导转化按树。
[0021] 根瘤农杆菌介导的植物遗传转化方法是目前应用最为广泛的转化方法之一,已成 功的应用于单、双子叶植物的转基因研究中。本发明最终构建的干扰载体pART27-TPS-RNAi 适合超毒力菌株EHA105等农杆菌介导的植物遗传转化。利用根瘤农杆菌EHA105将其导入 按树,所得到的转基因植株可W使按树植株内的TPS基因发生RNA沉默现象,使a-羡締、 a-松油醇W及1,8-按叶油素不能合成或积累,从而降低了植物的化感物质含量。
[0022] 本发明利用根癌农杆菌介导的转化的方法进行按树的遗传转化,借助按树细胞 Rd化的转录作用,产生RBSDV的S10基因,再由Dicer III的作用产生siRNA,沉默按树中 TPS基因的表达,从而达到利用RNA干扰降低化感物质的合成或积累,最终筛选出低含量化 感物质的转基因按树植株。
[0023] 本发明已得到W按树重要树种赤按为受体的按树TO代再生植株,转化载体 pART27-TPS-RNAi的植株是105株,通过人工接种的方法在溫室进行了化感物质的分析,其 中15株的化感物质(a-羡締,a-松油醇,1,8-按叶油素)降低75%左右,10株的降低45% 左右,7株的降低25%左右。经PCR检测,化感物质减少的32株全部扩增到目的基因,运说 明转基因按树植株的化感物质较受体有明显的降低。
[0024] 利用本发明的干扰载体转化所得的降低化感物质含量生物体可W是任何微生物、 植物或其组织、细胞,W及由此所获得具有任何降低化感物质含量的微生物、植物,W及该 类植物后代的种子、杂交和转育后代。
[00巧]本发明的有益效果在于:本发明为降低按树化感作用基因工程提供了一种干扰祗 类物质合成酶的基因、其相关的RNA干扰表达载体W及应用,为RNA干扰及转基因技术在林 木分子育种中的应用提供了新的思路。将该载体转入按树中,成功获得了低化感作用的植 株。实现了利用RNA干扰原理获得低化感作用按树新材料的预期目标,为RNA干扰介导的 按树分子育种及基因工程提供了成功的实例,弥补了 RNA干扰介导的降低化感作用在本领 域研究中的空缺,同时为按树的分子育种提供了一条快速高效的转基因方法。本发明通过 转基因方式降低了按树的化感作用,克服了现有技术中周期长、效率低的缺点,利用遗传转 化方法提供了一种快速、高效降低按树化感作用的方法,对于降低按树的化感作用,改善我 国南方地区按树人工林的生态环境和推动我国林业的可持续发展具有重要的意义。
【附图说明】 阳0%] 图1. TPS-P1片段电泳图;
[0027]泳道 1. lOObp plus marker, 2. TPS-P1
[0028] 图2. TPS-P2片段电泳图;
[0029] 泳道 1. lOObp plus marker, 2. TPS-P2
[0030] 图3. TPS-P3片段电泳图;
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