一种还原型辅酶复合试剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种稳定的还原型辅酶复合试剂及其应 用。
【背景技术】
[0002] 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，辅酶I)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP， 辅酶II)，这两种辅酶都有氧化型和还原型两种形式，氧化型用NAD+及NADP+表示，还原型用 NADH及NADPH表示，其分子中的吡啶环可接受[H+]，在脱氢酶的作用下，它们可以传递作用 物分子的氢。生物体内有许多以NAD+或NADP+作为辅酶的脱氢酶，NADH和NADPH在340nm 处有特异吸收峰，所以临床检验学上广泛利用NADH和NADPH的特点，作为监测生化反应的 指标，用来计算被测物的浓度或者活力，例如，酶法肌酐试剂、门冬氨酸转移酶试剂、丙氨酸 氨基转移酶试剂、a-羟丁酸脱氢酶试剂、乳酸脱氢酶试剂、尿素测定试剂等；此外，NADH和 NADPH可以作为酶循环反应的辅酶参与反应，使反应信号循环放大，提高检测的灵敏度，例 如在总胆汁酸测定技术中，Thio-NAD可以与3a-HSD-起特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类 固醇和还原性辅酶（NADH)，体系中有一定量的NADH存在时，又反向生成Thio-NAD和胆汁 酸，每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸， 产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶（Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的 吸光度变化，测得总胆汁酸的含量。
[0003] 中国专利申请CN1179792A提供了一种保持还原型辅酶的方法，该方法是在反应 体系中引入一个不干扰测定的化学反应，利用酶和底物将已氧化的辅酶还原成还原型辅 酶，使得在存储过程中还原型辅酶再生，但这种催化反应速度比较慢，实施的成本比较高、 某些酶不太容易获得，且加入的酶本身也存在稳定性的问题。美国专利US5278044提供了 一种脂质体包裹来稳定还原型辅酶的方法，该方法主要用于药物或化妆品的制作，并不适 用于临床诊断试剂。美国专利US5278044提供了用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲体系来稳定NADH 的方法，该方法主要特点是pH值为9. 5~11. 0,其中最佳pH值为10. 0~10. 4之间，但在 实际应用过程中过高的pH值限制了缓冲体系的选择，且很多酶在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲体 中活力会受到影响，这就限制了其应用。中国专利申请CN1311335A提供的pH值为8. 5~ 11. 0,溶液中含有0. 5~50mM的金属离子螯合剂的试剂；中国专利申请CN101140279A提供 了一种含有缓冲液、稳定剂、有机溶剂、螯合剂和无机盐的还原型辅酶的复合稳定剂，以上 两种试剂中均含有螯合剂，再加入某些酶时，可能会影响酶的稳定性而限制其应用。
[0004] 现有的还原型辅酶溶液一般由还原型辅酶、金属离子螯合剂和缓冲液、无机盐及 有机溶剂等组成，再加入某些酶时，存在稳定时间较短的缺陷，在2-8°C条件下储存的过程 中，稳定性发生变化，这种特性导致其随着放置时间的延长试剂颜色由无色或淡黄色而逐 渐变成红色，测定结果降低，在应用时影响检测结果的准确性；2-8°C开盖使用状态下，稳定 性发生变化，测定结果降低，不能满足检测的要求。
[0005] 因此有必要提供一种新的、稳定性好、可以与某些酶类混合使用的还原型辅酶溶 液，用于临床生化试剂中。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有的还原型辅酶溶液在加入某些酶时，存在的稳定时间 短的缺陷，提供了一种可稳定还原型辅酶的复合试剂，所述复合试剂的组成成分包括：
[0007] 还原型辅酶、缓冲液和稳定剂；其中，所述缓冲液选自由2_(环己胺）乙磺酸缓冲 液、3-(环己胺）-1_丙磺酸缓冲液、3-(环己胺）-2_羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲 基）-3_氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液和三乙醇胺缓冲液所 组成的组中的一种。
[0008] 可选的，所述稳定剂选自由核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KC1、MgCl2、牛血清白蛋 白和金属离子螯合剂所组成的组中的一种或多种。
[0009] 可选的，在所述复合试剂中还原型辅酶的浓度为0. 01-10g/L，优选为0. 5_6g/L; 缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mm〇l/L;稳定剂的浓度为0. 5-20g/L，优选 为 3-10g/L。
[0010] 可选的，所述缓冲液的缓冲容量为0? 05-lmol/L。
[0011] 可选的，所述复合试剂的pH为8. 5-10. 0。
[0012] 可选的，所述缓冲液为2_(环己胺）乙磺酸缓冲液、3_(环己胺）-1_丙磺酸缓冲 液、3-(环己胺）-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲基）-3-氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三 羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液或三乙醇胺缓冲液，所述稳定剂为核苷酸、核苷酸衍生 物、NaCl、KCl、MgCl2、牛血清白蛋白、金属离子螯合剂所组成的组中的至少一种。
[0013] 可选的，所述复合试剂还包括脱氢酶、牛血清白蛋白、有机溶剂、抗氧化剂、聚氧乙 烯类表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
[0014] 可选的，所述脱氢酶类为乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和3a-类固 醇脱氢酶中的至少一种；所述有机溶剂为乙二醇、丙三醇和1. 3-丙二醇中的至少一种；所 述抗氧化剂为巯基乙醇、二硫苏糖醇和谷胱甘肽中的至少一种；所述聚氧乙烯类表面活 性剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇对异辛基苯基醚中的至少一种；防腐剂为NaNjP Proclin300中的至少一种。
[0015] 本发明还提供了本发明所述的还原型辅酶复合试剂的应用。
[0016] 可选的，所述应用包括制备总胆汁酸测定试剂、酶法肌酐试剂、门冬氨酸转移酶试 剂、丙氨酸氨基转移酶试剂、a-羟丁酸脱氢酶试剂、乳酸脱氢酶试剂、尿素测定试剂。
[0017] 通过上述技术方案，本发明所提供的还原型辅酶试剂，在2_8°C开盖使用状态下的 稳定时间可以达到15-30天。在2_8°C密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个 月。
【具体实施方式】
[0018] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给 出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在 不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0019] 本发明提供了一种还原型辅酶复合试剂，所述复合试剂的组成成分包括：
[0020] 还原型辅酶、缓冲液和稳定剂；其中，所述缓冲液选自由2_(环己胺）乙磺酸缓冲 液、3-(环己胺）-1_丙磺酸缓冲液、3-(环己胺）-2_羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三（羟甲 基）-3_氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液和三乙醇胺缓冲液所 组成的组中的一种。
[0021] 其中，还原型辅酶和稳定剂均溶解于缓冲液中形成稳定且均一的溶液。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的缓冲容量为0. 05-lmol/L。优选的，为 了获得更好的稳定效果，缓冲液为N-三（羟甲基）-3-氨基丙烷磺酸（TAPS)缓冲液或3-三 羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸（TAPSO)缓冲液。
[0023] 可选的，所述复合试剂的pH为8. 5-10. 0,优选的pH为9. 0-9. 5。
[0024] 根据本发明的复合试剂，所述稳定剂选自由核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KCl、 MgCl2、牛血清白蛋白和金属离子螯合剂所组成的组中的一种或多种，优选的，为了获得最 佳的稳定效果，所述稳定剂选自核苷酸和核苷酸衍生物中的至少一种。
[0025] 其中，所述核苷酸和核苷酸衍生物为腺苷酸、鸟苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核 苷酸、腺苷5'-二磷酸钠盐、腺苷5'-二磷酸钾盐、腺苷-3'，5'-环单磷酸钠盐、鸟 苷-3' ,5'-环单磷酸钠盐、鸟嘌呤核苷_5'_二磷酸二钠、胞嘧啶核苷酸二钠、尿苷二磷 酸二钠等。
[0026] 其中，所述金属离子螯合剂为EDTA. 2Na和EDTA. 2K中的至少一种。
[0027] 可选的，在所述复合试剂中，还原型辅酶的浓度为0. 01-10g/L，优选为0. 5_6g/L; 缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mm〇l/L;稳定剂的浓度为0. 5-20g/L，优选 为 3-10g/L。
[0028] 其中，所述缓冲液的终浓度表示利用缓冲液、还原型辅酶和稳定剂等组分配制所 述复合试剂后，复合试剂中起缓冲作用的有效成分的终浓度，例如，当所述缓冲液为N-三 (羟甲基）-3_氨基丙烷磺酸（TAPS)时，缓冲液的终浓度表示配制获得的复合试剂中N-三 (羟甲基）-3_氨基丙烷磺酸（TAPS)的浓度。当缓冲液由两种或两种以上有效成分组成时， 缓冲液的终浓度指代几种有效成分的总浓度。
[0029] 在本发明的一种优选的实施方式中，所述缓冲液为N-三（羟甲基）-3_氨基丙烷 磺酸（TAPS)或3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸（TAPSO)，所述稳定剂为腺苷-3'，5'-环 单磷酸钠盐和鸟苷-3'