快速鉴定瘤胫实蝇的ss-pcr特异性引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及快速鉴定瘤胫实蝇的SS-PCR特异性引物 及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 瘤腔实绳Bactroceratuberculata(Bezzi)是一种重要的入侵检疫性害虫，属双 翅目Diptera实绳科Tephritidae果实绳属Bactrocera果实绳亚属Bactrocera。目前主 要分布在老挝、緬甸、不丹、中国的云南。由于国际贸易的日渐频繁，合作领域不断拓宽，在 进出境的果蔬中经常截获各种不同的实蝇幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体；对于 幼虫的分类鉴定要比成虫困难得多，为了保证鉴定的准确性通常是将幼虫在室内饲养为成 虫，而这需要花费较长的时间，严重影响了果蔬进出口贸易的通关速度；而对于残体则是无 法对其进行正确的识别。因此为了防止检疫性实蝇传入以及扩散，迫切需要开展关于实蝇 的快速鉴定识别的技术。
[0003] 近年来，由于分子生物学技术能解决传统的形态学分类方法难以解决的问题 且不受虫态的影响，越来越多的分子生物学技术被运用于昆虫的鉴定中，种特异引物 PCR(Species-specificPCR，SS_PCR)技术，即在设计目标物种的引物时必须充分考虑引物 的特异性，使得在扩增未知模板时能够根据目标片段条带的有无就能把目标种类与其他种 类鉴别开来。本发明提供了一种采用特异性引物快速鉴定瘤胫实蝇的方法，能够准确及时 对截获的疑似瘤胫实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等进行鉴定，建立了一种快速鉴定瘤胫 实蝇的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供快速鉴定瘤胫实蝇的SS-PCR特异性引物。
[0005] 本发明的再一目的是提供快速鉴定瘤胫实蝇的试剂盒。
[0006] 本发明的再一目的是提供快速鉴定瘤胫实蝇的方法。
[0007] 根据本发明的快速鉴定锈实蝇的SS-PCR特异性引物，引物序列为：
[0008] LJF400:5' -ACTCTGTTTAGCCGGGATCT-3' ；
[0009]LJR564:5 ' -CCGGCTAAAACTGATGGAGA-3 '。
[0010] 选择番石植实绳B.correcta，、桔小实绳B.dorsalis、颜带实绳B.cilifer、锈实 绳B.rubigina、瘤腔实绳B.tuberculata、杨桃实绳B.carambolae、瓜实绳B.cucurbitae、 辣椒实绳B.latifrons、南瓜实绳B.tau、具条实绳B.scutellata、近黑颜实绳B.parater、 黑膝实绳B.scutellaris、何氏华实绳B.hochii、率实绳Carpomyavesuviana、瓜棍腹实绳 Dacuslongicornis、腿端黑实绳B.atrifemur、黑颜实绳B.diaphora作为阴性对照来证明 本发明设计的引物的特异性，大大缩短了锈实蝇的鉴定周期。
[0011] 上述引物对扩增得到的鉴定瘤胫实蝇的特异性片段的序列为：
[0012] 5 '-ACTCCACTTAGCCGGGATCTCCTCAATTTTAGGGGCAGTTAATTTCATTACAACAGTAATTAAT ATGCGATCAACAGGGATTTCTTTTGACCGAATACCACTTTTCGTTTGAGCAGTTGTATTAACGGCCTTATTACTT TTATTGTCTCTGCCAGTTTTAGCCGG-3 '
[0013] 本发明具体提供了一种采用特异性引物快速鉴定瘤胫实蝇的方法，具体方法如 下：
[0014](1)通过种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出了1对瘤胫实蝇 的特异性引物LJF400 :5' -ACTCTGTTTAGCCGGGATCT-3'；
[0015]LJR564:5 ' -CCGGCTAAAACTGATGGAGA-3 '。
[0016](2)采用SSR-PCR引物的种特异性的检验：选用番石植实绳B. correcta，、桔小实 绳B. dorsalis、颜带实绳B. cilifer、锈实绳B. rubigina、瘤腔实绳B. tuberculata、杨桃实 绳B. carambolae、瓜实绳B. cucurbitae、辣椒实绳B. latifrons、南瓜实绳B. tau、具条实绳 B. scutellata、近黑颜实绳B. parater、黑膝实绳B. scutellaris、何氏华实绳B. hochii、率 实绳Carpomya vesuviana、瓜棍腹实绳Dacus longicornis、腿端黑实绳B. atrifemur、黑 颜实蝇B. diaphora作为阴性对照，瘤胫实蝇为阳性对照，验证锈实蝇特异性引物的种特异 性。结果表明，仅锈实蝇在165bp处有一条特异性扩增的条带，阴性对照均无特异性目标片 段，从而证明该引物在实验涉及的这些实蝇种类范围内，能特异性的鉴定瘤胫实蝇。
[0017] 一方面，引物的特异性是本实验成功的关键，特异性片段要有足够变异能够将不 同物种区分开。另一方面，当口岸仅发现卵或是残体时，即只能提取到微量DNA时，SS-PCR 检测鉴定方法的灵敏度就至关重要了。根据本发明的技术方案具有较高的灵敏度，能检测 到的DNA模板浓度可低至5. 597ng/uL，同时该SS-PCR特异性引物能够稳定区分近似物种， 因此，本发明的检测鉴定方法在实际检疫工作中也得到应用和验证。
[0018] 综上所述，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定瘤胫实蝇的方法具有快速简便、特异 性尚、灵敏度尚等优点，可以在8小时之内完成镑实绳的鉴定，能够满足口岸检验检疫快速 通关的要求。
【附图说明】
[0019] 图1显示利用通用型引物LC01490和HC02198对提取的实蝇DNA模板进行质量 检测的结果，（M:50bpDNALadder，l:番石植实绳B.correcta，2:桔小实绳B.dorsalis， 3 :颜带实绳B.cilifer，4 :锈实绳B.rubigina，5 :瘤腔实绳B.tuberculata，6 :杨桃实绳 B.carambolae，7 :瓜实绳B.cucurbitae，8 :辣椒实绳B.latifrons，9 :南瓜实绳B.tau，10 : 具条实绳B.scutellata，11 :近黑颜实绳B.parater，12 :黑膝实绳B.scutellaris，13 :何 氏华实绳B.hochii，14 :率实绳Carpomyavesuviana，15 :瓜棍腹实绳Dacuslongicornis， 16 :腿端黑实绳B.atrifemur，17 :黑颜实绳B.diaphora，18 :空白对照ddH20。
[0020] 图2引物LJF400和LJR564的种特异性验证，M:IOObpDNALadder，1 :瘤胫 实绳B.tuberculata，2 :番石植实绳B.correcta，3 :桔小实绳B.dorsalis，4 :颜带实绳 B.cilifer，5 :锈实绳B.rubigina，6 :杨桃实绳B.carambolae，7 :瓜实绳B.cucurbitae， 8 :辣椒实绳B.latifrons，9 :南瓜实绳B.tau，10 :具条实绳B.scutellata，11 :近黑颜实绳 B.parater，12 :黑膝实绳B.scutellaris，13 :何氏华实绳B.hochii，14 :率实绳Carpomya vesuviana，15 :瓜棍腹实绳Dacuslongicornis，16 :腿端黑实绳B.atrifemur，17 :黑颜实 绳B.diaphora，18 :空白对照ddH20。
[0021] 图 3 引物LJF400 和LJR564 的灵敏度验证，M:100bpDNALadder，I:10°，2 :10 \ 3 :10 2,4 :10 3,5 :空白对照ddH20。
[0022] 图4显示SS-PCR快速鉴定瘤胫实蝇的应用与验证M:100bpDNALaddenl-12 :瘤 腔实绳B.tuberculata，13 :空白对照ddH20。
【具体实施方式】
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