一种应用鲢鱼检测养殖水体中污染物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境检测技术领域，具体涉及一种应用鲢鱼检测养殖水体中污染物的 方法。
【背景技术】
[0002] 水产品是海洋和淡水渔业生产的动植物的统称，如鱼类、虾类、蟹类等。我国既是 水产品生产大国，同时也是消费大国。水产品的质量安全不仅关系着我国人民的生活健康， 也影响着水产品行业的发展，因此对水产品的质量安全检测具有重要意义。随着农、兽药的 滥用及环境污染的日益加剧，生物体持续暴露在多种污染物交叉的环境中，造成了其同时 遭受多种污染的现象。目前，对水产品中有毒有害物质的常规检测是各种化学手段，但其只 能针对部分有毒有害物质进行检测，并且对被生物体吸收代谢转化成的次级代谢产物无法 检测，同时还可能由于漏检某种有毒有害物质而产生严重后果。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种应用鲢鱼检测养殖水体中污染物的方法，即采用鲢鱼体 内谷胱甘肽硫转移酶（GSTs)的含量变化来检测养殖水体中污染物的方法。
[0004] 本发明的检测养殖水体中污染物的方法，包括如下的步骤：
[0005] 1)从鲢鱼肝脏组织中提取RNA，然后以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA;
[0006] 2)用引物对步骤1)反转录合成cDNA进行荧光定量PCR检测，所述的引物为引物 的序列信息如下：
[0007]GSTs正向引物LI:ccgttaggacgtcatgtaacgtc(SEQIDNO: 1)、
[0008]GSTs反向引物L2ccaggtgagtgtgccttca(SEQIDNO:2)、
[0009] 设计的内参的序列信息如下：
[0010]LGl:gagaggtatcctgactctg(SEQIDNO:3)、
[0011]LG2 :gacttagcactgtgtgtacc(SEQIDNO:4);
[0012] 为了提高检测的灵敏度，正向引物的序列改造为cagttaggacgtcatgtcacgtc(SEQ IDNO:5)；
[0013] 3)通过对谷胱甘肽硫转移酶基因表达量的变化进行对比分析。
[0014] 所述的污染物，可以是农兽药、PAH、PCB、毒素、重金属、环境内分泌物。
[0015] 本发明的方法相比目前的仪器化学方法，其检出限更低，方法更加灵敏。且验证实 验室一致认为该方法准确、灵敏、操作简单、重复性好；不使用有毒的有机溶剂和标准品，对 操作人员的安全更有保障，同时减少了对环境的污染；缩短了检测时间，降低了检测成本， 有效地提升了实验室的检测能力。通过该项目的深入研究，可建立与国际接轨的食品安全 生物检测体系。
【附图说明】
[0016] 图I:基因的荧光定量PCR扩增曲线图。由图看出，扩增曲线的整体平行性较好， 曲线拐点清楚，基线平而无上扬现象。各管的扩增曲线平行性较好，表明扩增效率相近，可 以用来进行荧光定量PCR，分析基因的表达水平。
[0017] 图2 :待测基因的荧光定量PCR溶解曲线图。利用荧光定量PCR的方法测试了部 分基因的表达水平，并得到了这些基因的扩增溶解曲线（如图）。溶解曲线可以反映出实时 荧光定量PCR的扩增特异性，如果每条溶解曲线只有一个峰，表明扩增的特异性较好，如果 有两个或者多个峰，则表明荧光定量PCR过程中存在非特异扩增。由图可知：这些基因的溶 解曲线只有一个峰，这表明基因的特异性扩增效果较好，可以用来进行荧光定量PCR，分析 基因的表达水平。
[0018] 图3 :鲢鱼在受到孔雀石绿污染时GSTs基因表达量随时间的变化图。利用荧光定 量PCR方法测定了孔雀石绿对鲢鱼谷胱甘肽S转移酶基因表达水平的影响。考察了孔雀 石绿在20yg/L浓度时（实验组），不同作用时间对鲢鱼GSTs表达量的影响，分别选取了 24h、48h、72h、96h、120h对实验组的GSTs的基因表达量进行分析（对照组为同样条件下不 添加孔雀石绿养殖的鲢鱼，设置为100)。由图可以看出：在受到孔雀石绿污染诱导后，鲢鱼 在72h内GSTs相对表达量急剧增多，可能与通过鱼鳃吸收较快有关，而在72h之后表达量 增长缓慢，相对平稳，可能与孔雀石绿已经降解有关。因此，本实验后续工作选取72h作为 考察时间。
[0019] 图4:鲢鱼GSTs基因表达量随孔雀石绿浓度变化的表达图。经查阅文献得知，水 中孔雀石绿在0. 03mg/L就就有较好的杀菌效果，因此，本实验组的给药浓度依次设定为5、 10、20、30和40yg/L。由图可知，随着给药浓度的增大，鲢鱼GSTs基因相对表达量也随之明 显增加，仅在5yg/L浓度时其相对表达量就达1. 4倍，变化明显；其在在30yg/L和40yg/ L浓度时相对表达量持平，说明酶的表达在高浓度孔雀石绿中可能会受到抑制。
[0020] 图5 :鲢鱼在受到溴氰菊酯污染时GSTs基因表达量随时间的变化图。利用荧光定 量PCR方法测定了溴氰菊酯对鲢鱼谷胱甘肽S转移酶基因表达水平的影响。考察了溴氰菊 酯在4mg/L浓度时对鲢鱼不同作用时间（实验组），分别选取了 24h、48h、72h、96h、120h对 实验组的GSTs的基因表达量进行分析（对照组为同样条件下不添加溴氰菊酯养殖的鲢鱼， 设置为100)。由图可以看出：鲢鱼在72h内GSTs相对表达量急剧增多，而72h后相对平稳， 可能是在溴氰菊酯的诱导下该酶和底物的结合开始趋于饱和；综合其他因素，本实验选取 了 96h作为考察时间。
[0021] 图6 :鲢鱼GSTs基因表达量随溴氰菊酯浓度变化的表达图。经查阅相关资料，实 验组在溴氰菊酯经口给药浓度l〇mg/L时，72h后，鲢鱼死亡，本实验选定在养殖水体中溴氰 菊酯的给药浓度分别选择了 1、2、4、6和8mg/L。由图看出：随着给药浓度的增大，鲢鱼GSTs 基因相对表达量也随之增加，并表现出对溴氰菊酯敏感，其GSTs基因相对表达量在8mg/L 时高了 2倍多；其在4mg/L、6mg/L和8mg/L浓度时表达量趋于平稳，说明该酶在这个浓度下 开始趋于饱和。
[0022] 图7 :鲢鱼在受到多氯联苯污染时GSTs基因表达量随时间的变化图。利用荧光定 量PCR方法测定了PCBs对鲢鱼谷胱甘肽S转移酶基因表达水平的影响。考察了PCBs在 Iyg/L浓度时（实验组），不同作用时间对鲢鱼GSTs表达量的影响，分别选取了 24h、48h、 72h、96h、120h对实验组的GSTs的基因表达量进行分析（对照组为同样条件下不添加多氯 联苯养殖的鲢鱼，设置为100)。由图可以看出：鲢鱼在120h之内未达到平稳期，且一直呈 现上升趋势，说明PCBs-直在诱导GSTs表达，其在体内蓄积并难以代谢，导致其GSTs酶一 直处于超表达状态。在120h时，鲢鱼GSTs相对表达量达到了 2. 5倍之多。因此，本实验选 取了 120h作为考察时间。
[0023] 图8 :鲢鱼GSTs基因表达量随孔雀石绿浓度变化的表达图。经过文献查阅，鱼的 LD50为PCBs1-10yg/kg，96h;5yg/L，45d。本实验选定了在养殖水体中的给药浓度分别 为0. 1、0. 5、1和2yg/L。由图看出：随着给药浓度的增大，GSTs基因相对表达量也随之增 加，其中，在PCBs浓度达2yg/L时，鲢鱼高了 2. 5倍；尤其值得一提的是，在PCBs浓度为 0. Iyg/L时，鲢鱼中GSTs基因相对表达量时就高了 1. 5倍，这说明鲢鱼的GSTs对PCBs的 诱导反应很敏感，GSTs非常适合作为一种生物标志物来监测环境中PCBs存在情况。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述
[0025] 实施例1
[0026] 1、从鲢鱼肝脏组织中提取RNA，反转录合成cDNA;
[0027]材料：
[0028]鲢鱼肝脏；RNA提取试剂盒，RNApreppureTissueKit，Tiangen;反转录Prime ScriptRT试剂盒：TaKaRa，日本；移液器；一次性注射器；方盘；镊子；手术剪；培养皿； 1. 5mL离心管。
[0029] 试剂材料
[0030] 95 % 的RNase-free乙醇；0? 1 %DEPC处理水；SVRNALysisBuffer;SVRNA dilutionBuffer；SVRNAWashSolution；YellowcoreBuffer；MnCl20. 09M；DNaseI；SV DNaseStopSolution;Nuclease_Freewater;琼脂糖；10XTAE电泳缓冲液（40mMTris， 20mMNaAc，ImMEDTAP