一种鲤春病毒血症病毒的荧光定量pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水生病毒检测领域，特别是鱼类鲤春病毒血症病毒的快速检测。
【背景技术】
[0002] 鲤春病毒血症（Springviraemiaofcarp，SVC)是一种以出血为主要临床症状 并伴有高度传染性的急性流行病，其病原为鲤春病毒血症病毒（Springviraemiaofcarp virus，SVCV)。鲤春病毒血症病毒在鲤、锦鲤、草鱼、鲢、鳙、鲫等鲤科鱼类中均可导致明显的 症状，但普通鲤鱼是其最主要、最敏感的宿主，并且各个年龄段的鲤鱼都能被感染。该病毒 常于春季在水温8~20°C，尤其是13~15°C时爆发流行，水温超过22°C时不发病。 水温越适宜、鱼体健康状况越差越容易感染，病鱼全身出血及严重腹水、发病急、死亡率高， 死亡率可高达90%左右，严重危害渔业生产并造成毁灭性打击，世界动物卫生组织OIE将其 列为必须申报的重要疫病。2008年，农业部第1125号公告更是将该病列为"中华人民共和 国进境动物一类传染病"，也是唯一一个被列为一类传染病的鱼类疫病，因此成为鱼类口岸 检疫的第一类检疫对象。
[0003] 目前，尚缺乏有效控制鲤春病毒血症病毒的药物和方法。国际上通行的控制该病 的有效措施是进行鲤春病毒血症的监测，及早发现并进行隔离或扑杀。该病的诊断主要依 赖于实验室的检测，因此建立快速、灵敏、准确的检测方法至关重要。目前，鲤春病毒血症病 毒的检测方法包括细胞学诊断、免疫学诊断及分子生物学诊断三大类。
[0004] 细胞学诊断技术主要是利用细胞分离培养病毒和电镜观察。该类方法操作繁琐， 检测周期长，灵敏度低。
[0005] 免疫学诊断技术主要包括酶联免疫吸附测定（ELISA)和免疫荧光方法。该类方法 灵敏度较高，但对抗体要求也高，已有报道表明针对鲤春病毒血症病毒欧洲株制备的抗体 不能用于检测亚洲株。另外，该类方法操作也相当繁琐，大量样本检测工作量巨大。
[0006] 分子生物学诊断技术主要包括传统聚合酶链式反应（PCR)方法以及荧光PCR方 法。目前，鲤春病毒血症病毒检测的国家标准是通过两轮普通的PCR组成的套式PCR方法。 然而，传统的PCR方法只能定性，不能定量，灵敏度也较低。此外，鲤春病毒血症检疫技术规 范SN/T1152-2011也采用了荧光定量PCR技术进行鲤春病毒血症病毒的检测。但是，这两 种方法所采用的扩增引物均是针对病毒G基因进行设计的，然而由于鲤春病毒血症病毒是 RNA病毒，G蛋白又是病毒表面糖蛋白，G基因变异很快，基因序列的变异严重影响了其检测 的准确度和灵敏度，容易造成假阴性结果，导致误判，最终造成疫病的进一步扩散。例如， 2014 上海分离株SH140503(Genebank注册号：KR012467)和SH140522(Genebank注册号： KR012468)利用针对G的荧光定量PCR方法均不能被有效检测到。
[0007] 基于以上原因，设计更加灵敏可靠的检测方法尤为重要。一方面，我们对鲤春病毒 血症病毒基因组序列分析表明，相对于G基因，核蛋白编码基因N在进化上更为保守。另一 方面，弹状病毒科狂犬病毒、水疱性口炎病毒等研究表明，它们基因组转录水平N>P>M>G>L， 并且依次递减约20%-30%，因而N基因的转录水平高于G基因。因此，我们推测同为弹状病 毒科成员的鲤春病毒血症病毒中N基因的转录水平也高于G基因。在鲤春病毒血症病毒感 染组织中，不仅仅存在完整的病毒粒子，也存在大量的基因组转录产物，而病毒粒子包装的 基因组中N基因和G基因是等量的，因此，病毒感染组织中，N基因的总拷贝数应大于基因 的拷贝数。基于以上理论，我们针对N基因的保守区域，设计并筛选出了一对荧光定量PCR 引物和对应的荧光探针，以便更加灵敏准确的检测鲤春病毒血症病毒。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种比现有方法更为灵敏、准确、高特异性的采用针对鲤春 病毒血症病毒N基因的特异性引物和荧光探针，通过荧光探针或SYBRGREENI荧光染料实 时定量PCR检测鲤春病毒血症病毒的方法，以克服现有技术的不足。
[0009] 本发明的技术方案包括以下步骤： 1) 、荧光PCR引物及探针的设计： 首先根据美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库Genbank上所有鲤春病毒 血症病毒N基因序列，针对N基因的序列保守区，利用PrimerExpress3.0软件设计特异 性的引物序列和荧光探针序列，如下： 正向引物：N-TFl:ATCAGGCCGATTATCCTTCCA; 反向引物：N-TRl:AGATAAGCAITCACATGCTGTAT; 荧光探针：N-tagl:5' -FAM-TCTCCACCAGTCCCATATAGACATAITGCCT-TAMRA-3'; 荧光探针的5 '端标记荧光报告基团FAM，3'端标记荧光淬灭基团TAMRA，扩增片 段长度151bp; 2) 、病毒RNA的提取： 采用经典的Trizol法或商业化试剂盒提取待测样品总RNA; 3) 、反转录及cDNA的获得： 反转录体系及条件：在200yIPCR反应管中依次加入2yg步骤2中的待测样品总RNA、1yl随机六聚体引物、补充无RNA酶水至总体积12yl;于65。C反应5min，立 即置于冰上，然后加入 4yI5XReactionBuffer，IyIRiboLockRNaseInhibitor，2 yl10mMdNTPMix和IylRevertAidM-MuLVRT(美国Thermo公司），25°C反应 5min，之后42°C保温45min获得病毒cDNA; 4) 、荧光PCR反应体系建立： 可以采用两种实时荧光PCR反应体系： TaqMan荧光探针法：在200yl荧光PCR反应管中依次加入10yl2XPremixEx Taq(TAKARA公司），浓度10ymol/L的正向引物、反向引物各0.4yl，0.8yl浓度 10ymol/L的焚光探针，0.4yIROXreferencedyeII和IyIcDNA模板，置于ABI 7500Fast荧光定量PCR仪中进行反应，反应条件为94°C30s;之后94°C3s、60°C 30s40个循环； SYBRGreenI荧光染料法：在200yl荧光PCR反应管中依次加入10yl2XSYBR PremixExTaq(TAKARA公司），浓度 10ymol/L正向引物、反向引物各 0.4yl，0.4yl ROXreferencedyeII和IylcDNA模板，置于7500Fast荧光定量PCR仪中进行反应， 反应条件为95°C30s;之后95°C5s、60°C30s、72°C30s40个循环，结束后， 立即由仪器进行熔解曲线分析，最后通过ABI7500 2. 0.6软件计算扩增产物Tm值； 5 )、标准曲线的制备： 为了准确定量样本中病毒的拷贝数，制备含有目的扩增片段的质粒作为标准品以绘制 标准曲线；首先设计N基因的正向引物和反向引物，扩增鲤春病毒血症病毒SVCV-265株基 因组得到1261bp的扩增产物，按照经典的分子克隆操作方法，将其连接到pMD18-T载体 上，命名为pMD/SVCV-N，筛选阳性克隆并提取质粒DNA，利用分光光度计测定质粒浓度，即 为标准品；将其进行10倍梯度稀释，之后进行TaqMan荧光PCR反应；根据标准品的浓度和 Ct值，仪器软件会自动绘制出荧光定量标准曲线； 6 )、检测结果判定： 利用荧光定量PCR反应收集荧光信号，再利用仪器软件处理数据，得到扩增曲线、熔解 曲线、Ct值、Tm值；以标准品最低浓度对应的Ct值作为检测下限，以标准品对照的Tm值作 为SYBRGREENI荧光染料法判定依据。
[0010] 本发明通过对GenBank中所有鲤春病毒血症病毒基因组序列进行进化分析以及 各基因的突变速率计算，建立了针对鲤春病毒血症病毒N基因的荧光定量PCR检测方法，设 计并筛选了一对引物及探针，与已有的针对G基因的荧光定量PCR方法进行比较，发现本发 明具有更加灵敏、准确、高特异性的特点。与现有技术相比，本发明具有以下优点：