长效单链胰岛素类似物的制作方法
【专利说明】长效单链胰岛素类似物
[0001] 相关申请的交叉参考 本申请要求2012年11月5日提交的未决美国临时申请号61/722, 350的权益。
[0002] 关于联邦资助的研究或开发的声明 本发明是由 National Institutes of Health 在经费项目编号 DK040949 和 DK074176 下在合作协议下政府支持完成。美国政府对本发明可能享有某些权利。
[0003] 发明背景 本发明涉及多肽激素类似物，其表现出增强的药理学性质，如提高的热力学稳定性、增 强的对高于室温的热纤维化的抗性、降低的丝裂原活性和/或改变的药代动力学和药效动 力学性质，即相对于相应野生型人激素的可溶性制剂提供更长的作用持续时间或更快速的 作用持续时间。更特别地，本发明涉及由单一多肽链组成的胰岛素类似物，所述单一多肽链 在A和B结构域之间含有新的一类缩短的连接（C)结构域。这种类别的C结构域具有6-11 个残基的长度，由N-末端酸性元素和衍生自人IGF-II的连接结构域的C-末端片段组成。 本发明的单链胰岛素类似物在A或B结构域中的其它位点处可以任选含有标准或非标准的 氨基酸置换。
[0004] 非标准蛋白质（包括治疗剂和疫苗）的工程改造可以具有广泛的医疗和社会益处。 天然存在的蛋白质一一如通常在人类、其它哺乳动物、脊椎生物、无脊椎生物或真核细胞的 基因组中编码的那样一一常常赋予多种生物活性。衍生蛋白质的益处在于获得选择性活 性，如降低的与不期望和不利的副作用（如促进癌细胞生长）相关的同源细胞受体的结合。 社会益处的另一实例是对室温下或高于室温的降解的抗性提高，有利于运输、分布和使用。 胰岛素提供了治疗性蛋白质的一个实例。不管通过RNA剪接的替代方式或通过翻译后糖基 化的替代模式生成的受体同种型，结合到胰岛素受体的野生型人胰岛素和在其它哺乳动物 基因组中编码的胰岛素分子是多器官和多种类型的细胞。野生型胰岛素还以低亲和力与同 源1型胰岛素样生长因子受体（IGF-IR)结合。
[0005] 进一步的医药益处的实例是优化蛋白质对伸展或降解的稳定性。此类社会益处将 通过针对室温或高于室温下的降解比标准蛋白质更难熔的蛋白质工程改造来增强，以用于 电力与制冷不能始终可用的发展中世界的地区。由单一多肽链组成并任选含有非标准氨基 酸置换的胰岛素类似物可以表现出在抗热降解或降低的丝裂原活性方面优异的性质。糖尿 病在非洲和亚洲的未决流行加深了其物理降解造成的挑战。因为纤维化造成了高于室温的 降解的主要途径，设计抗纤维化的制剂可以在此类受挑战区域提高胰岛素替代疗法的安全 性和效率。
[0006] 施用胰岛素早已被确定为糖尿病的治疗方法。在患有糖尿病的患者中常规胰岛素 替代疗法的主要目的是严格控制血葡萄糖浓度以防止其偏离高于或低于健康人的正常范 围特征。偏离低于正常范围与即时肾上腺素或神经低血糖症状相关，这在严重发作时会导 致痉挛、昏迷和死亡。偏离高于正常范围与微血管病变(包括视网膜病、失明和肾衰竭相关） 的长期风险增加相关。
[0007] 胰岛素是在脊椎动物的代谢中起到重要作用的小球状蛋白质。胰岛素含有两条 链，含有21个残基的A链和含有30个残基的B链。该激素以Zn2+-稳定化六聚物形式存储 在膜岛β细胞中，但是以无 Zn2+单体形式在血流中起作用。膜岛素是单链前体 膜岛素 原的产物，其中连接区（35个残基)将B链的C-末端残基(残基Β30)连接到A链的N-末端 残基（图1Α)。各种迹象表明，其由胰岛素样核心和无序的连接肽组成（图1Β)。三种特定的 二硫键（Α6-Α11、Α7-Β7和Α20-Β19 ;图IA和1Β)形成被认为偶联到粗面内质网（ER)中胰 岛素原的氧化折叠。胰岛素原在由ER输出至高尔基体后不久组装形成可溶性Zn 2+-配位六 聚物。内切蛋白酶解消化并转化为胰岛素在未成熟的分泌颗粒中发生，随后发生形态凝聚。 已经通过电子显微镜法（EM)观察到成熟贮藏颗粒中锌胰岛素六聚物的结晶阵列。胰岛素序 列以图示形式显示在图IC中。个别的残基通过氨基酸同一性(通常使用标准三字母代码)、 链和序列位置(通常为上标形式）表示。与本发明相关的是长度6-11个残基的新型缩短的 C结构域替代人胰岛素原的36-残基野生型C结构域特性的发明。
[0008] 纤维化，作为在用于治疗糖尿病的胰岛素和胰岛素类似物的制造、储存与使用中 的严重问题，随着更高温度、更低pH、搅拌，或脲、胍、乙醇助溶剂的存在，或疏水性表面而 增强。目前的美国药物法规要求，如果以1%或更高的水平发生纤维化，胰岛素要被丢弃。 因为在更高温度下纤维化增强，患有糖尿病的患者最好在使用前必须将胰岛素保持冷藏。 胰岛素或胰岛素类似物的纤维化对使用其中将少量胰岛素或胰岛素类似物定期注入患者 体内的外部胰岛素栗的此类患者可能是特别关注的。在此类使用中，胰岛素或胰岛素类 似物在栗设备中不保持冷藏，胰岛素的纤维化会导致用于将胰岛素或胰岛素类似物注入 体内的导管堵塞，可能导致血糖水平不可预测地波动或甚至导致危险的高血糖症。在高 于25°C的温度下，每提高10°C，胰岛素表现出10倍或更高的降解速率的提高；因此，指南 要求储存在<30°C的温度下并优选冷藏储存。配制为pH小于5的可溶性溶液(如Lantus? (Sanofi-Aventis)，其含有在pH 4. 0下的甘精胰岛素和锌离子的未缓冲溶液）的基础胰岛 素类似物也会由于在室温下或高于室温下的物理降解而限制其自身的寿命；此类制剂中使 用的酸性条件削弱了胰岛素自组装，并减弱了锌离子的结合，降低了通过在锌-蛋白质组 装物中的螯合作用能保护胰岛素类似物的程度。
[0009] 胰岛素易于化学降解，涉及随分子中原子重排的损失的化学键断裂或不同胰岛素 分子之间的化学键形成。化学键方面的此类变化通常在蛋白质的未折叠状态下介导，由此， 提高其热力学稳定性的胰岛素的修饰也可能会延迟或防止化学降解。胰岛素还易于物理降 解。蛋白质纤维化的目前的理论认为，纤维化机理经由部分折叠的中间状态进行，其进而聚 集形成淀粉样蛋白的核。在该理论中，有可能的是稳定天然状态的氨基酸置换可能或可能 不稳定该部分折叠的中间状态，并可能或可能不提高(或降低）天然状态与中间状态之间的 自由能壁皇。因此，目前的理论表明，在双链胰岛素分子中给定的氨基酸置换提高或降低纤 维化风险的趋势是高度不可预知的。胰岛素分子结构模型设想三-α螺旋的近乎完全展开 (如在天然状态中看到的那样）以及B链的连续堆叠与A链的连续堆叠形成的β折叠的平 行排列；在链之间和在A链中的天然二硫化物配对得以保留。此类平行交叉β折叠要求在 A链的N末端与B链的C末端之间的显著分离（>30 Α)，这两个末端在胰岛素单体天然状态 中通常非常接近（〈10 Α)。具有缩短的C结构域的单链胰岛素类似物对纤维化的显著抗性 在本领域是已知的，并被认为反映了胰岛素原丝中平行交叉β折叠的展开结构与具有天 然二硫化物配对的单链胰岛素类似物的结构(其中缩短的C结构域将A链的N末端与B链 的C末端之间的距离限制为在原丝中不利）之间的拓扑不相容性。
[0010] 单链胰岛素类似物可能因此似乎提供了设计抗纤维化胰岛素类似物的有利途径。 但是，过去，此类类似物表现出低活性，其相对于野生型人胰岛素可为1%或更低。(虽然Lee， H. C.等人（2000)声称具有长度为57个残基或58个残基的野生型A-和B-结构域的单链 胰岛素类似物表现出相对于人胰岛素为30-40%范围的受体结合亲和力，该出版物因科学 上的不当行为在2009年被撤回；在我们手中，由Lee，Η. C.等人公开的类似物表现出小于 1%的相对亲和力。）可以通过引入AspB1° (-种本领域已知的用于提高胰岛素对胰岛素受体 的亲和力的置换)以部分恢复亲和力。我们此前已经描述过具有C结构域接头GGGPRR的含 有Asp B1°的57个残基的单链胰岛素。但是，在A结构域和/或B结构域中使用缩短的C结 构域和此类置换可以令结合比例向着相对于IR-B对IR-A的结合提高的比例倾斜，如题为 "Isoform-Specific Insulin Analogues" 的美国专利申请号 12/989, 399 (经此引用并入 本文）中所公开的那样。描述了具有高受体结合亲和力的单链胰岛素类似物，其中缩短的C 结构域是胰岛素样生长因子I (IGF-I ;序列GYGSSSRRAPQT ;SEQ ID NO: 12)的12个残基 的C结构域，产生嵌合蛋白。但是，此类嵌合分子表现出对IGF-IR提高的相对和绝对亲和 力。此类改变，如同与Asp B1°和在BlO位置处的其它置换相关的那些，由于可能与摄取此类 类似物的动物或人类患者中提尚的癌症风险相关联而引起了广泛的关注。针对基础膜岛素 类似物，即设计为随从皮下积存的12-24小时胰岛素吸收状况和12-24小时胰岛素作用状 况每日一次给药的那些，此类关注尤为显著。
[0011] 本发明出于医疗和社会需求，工程改造一种每日一次型基础单链胰岛素类似物， 其结合了（ i)对降解的抗性，与（ii)实质上体内降糖效力，以及（iii)降低的对IGF-IR的 交叉结合，和（iv)类似于野生型人胰岛素的对该胰岛素受体的A-和B-同种型的亲和力比。 后一目标反映了胰岛素在人体内的多效功能和靶组织。胰岛素作用的经典范例集中于作为 该激素的靶组织的脂肪细胞(其中胰岛素调节甘油三酯液滴形式的燃料储存)、肝脏(其中 胰岛素调节经由葡萄糖新生的葡萄糖生产，并调节糖原形式的燃料储存）和肌肉（其中胰岛 素调节葡萄糖由血流经由运输注入GLUT4的质膜)的器官特异性功能。但是，最近的研究已 经揭示，胰岛素在其它器官和组织中具有生理作用，如在大脑的下丘脑中，其中胰岛素响应 性神经回路影响肝代谢、食欲、饱腹感，并有可能影响理想体重的设定点。尽管人类基因组 含有编码该胰岛素受体的单个基因，含有胞质酪氨酸激酶结构域的跨膜蛋白，其前信使RNA 经历选择性剪接以产生不同的A和B同种型，其分布分数在各器官中可能不同，并且其信号 传导功能在相同细胞中可能不同。
[0012] 该A和B同种型(指定为IR-A和IR-B)在对胰岛素的亲和力方面