一种拟南芥zfn3蛋白多克隆抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 拟南芥，是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。拟南芥的 优点是植株小、每代时间短、结子多、生活力强。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中 最小的。其整个基因组已于2000年由国际拟南芥菜基因组合作联盟联合完成，也是第一个 被顺序分析的植物基因组。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率 很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。由于具有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学 研究的理想材料，被科学家誉为"植物中的果蝇"。
[0003] 转录因子是一组识别特异DNA序列的蛋白，能促进或抑制某些特定基因的转录及 表达，从而导致组织细胞结构和功能的改变。转录因子ZFN3是一种特殊的锌指蛋白（zinc finger protein)，它含有五个CCCH锌指结构，在拟南芥叶片衰老过程中，表达量逐渐升高。 拟南芥yuc6-lD的突变体，能够通过不断积累生长素，来推迟叶片的衰老，通过基因芯片 分析表明，ZFN3基因在该突变体中，表达量显著下降，ZFN3蛋白编码基因已经被北京大学 Leaf Senescence Database收录为调节叶片衰老的候选基因。但目前关于ZFN3蛋白的抗 体未见报道。
[0004] 因此有必要提供一种针对拟南芥ZFN3蛋白的多克隆抗体，从而为研究和利用该 蛋白的生物学功能提供有力工具。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于填补现有的拟南芥ZFN3蛋白检测领域的空白，开发一种针对 拟南芥ZFN3蛋白的多克隆抗体及其制备方法。
[0006] -种拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0007] (1)构建含有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示核苷酸序列的重组表达载体，将 所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；
[0008] (2)将所述重组蛋白抗原免疫动物，经血清分离纯化获得拟南芥ZFN3蛋白多克隆 抗体。
[0009] 其中，所述SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示核苷酸序列为发明人通过对拟南芥 ZFN3蛋白序列进行大量分析比对发现的两条特异性多肽片段的编码DNA。
[0010] 可选的，所述重组表达载体含有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。其中，SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列含有SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示核苷酸序列，为了使 得SEQ ID No :1和SEQ ID No :2所示的核苷酸序列所编码的多肽片段能够在大肠杆菌 感受态细胞中准确高效的表达获得重组蛋白抗原，发明人在这两段序列之间加入了一段 GGGGGGGGGGGGTCC 序列。
[0011] 可选的，所述重组表达载体是将含有SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的核苷酸 序列的片段克隆至原核表达载体获得的。
[0012] 可选的，所述重组蛋白抗原含有如SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示的氨基酸序 列。
[0013] 优选的情况下，所述重组蛋白抗原含有如SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列。
[0014] 本发明对于所使用的大肠杆菌感受态细胞的种类没有特别的限制，只要能够适合 重组表达载体在细胞中有效表达即可，优选的情况下，为了获得更好的表达效果，大肠杆菌 感受态细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。
[0015] 在本发明中，可以利用本领域常规适合于重组蛋白抗原的原核表达载体，优选的 情况下，当所述原核表达载体为pE-SUMOpro时，重组蛋白抗原的表达效果更好。
[0016] 在本发明所提供的方法中，免疫动物的步骤包括4次免疫，首先将纯化的重组蛋 白抗原与完全弗氏佐剂混合后第1次免疫动物，而后将纯化的重组蛋白抗原与非完全弗氏 佐剂混合后进行第2-4次免疫，每次免疫的时间间隔为14天。
[0017] 在本发明中，免疫动物时所使用的免疫剂量及与佐剂的混合比例都可以按照本领 域常规的方法进行。免疫的动物包括但不限于新西兰大白兔、小白鼠和大白鼠。
[0018] 在第四次免疫后第10天，取动物血液，收集抗血清，利用纯化试剂获得纯度不低 于80%的拟南芥ZFN3多克隆抗体。
[0019] 本分发明还提供了利用本发明所述的方法制备的拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体。 所述多克隆抗体能够特异性的识别ZFN3蛋白中的特异性氨基酸片段SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5,为ZFN3蛋白的特异性抗体。
[0020] 本发明还提供了所述的拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体的应用。所述应用包括制备 含有所述拟南芥ZFN3蛋白多克隆抗体的试剂或试剂盒，用于检测拟南芥ZFN3蛋白或进行 功能鉴定。
[0021] 本发明所提供的方法通过PCR方法克隆得到拟南芥ZFN3蛋白编码DNA中的两段 特异性片段的编码DNA，从而获得特异性的多克隆抗体。利用本发明所提供的方法制备的多 克隆抗体，能够特异性识别拟南芥ZFN3蛋白，而不能识别拟南芥其他蛋白，在ZFN3蛋白的 检测和功能鉴定、研究中具有广泛用途。ZFN3蛋白抗体的制备为在拟南芥中检测ZFN3蛋白 及研究ZFN3蛋白功能具有一定的意义。
【附图说明】
[0022] 图1为目的DNA的PCR扩增结果；
[0023] 图2为原核表达载体菌体PCR检测电泳图；
[0024] 图3为重组蛋白SDS-PAGE电泳图；
[0025] 图4为重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图，其中，M为蛋白Marker ; 1和2为纯化的 蛋白；箭头指示的条带为目标蛋白条带；
[0026] 图5为拟南芥Western检测图片。
【具体实施方式】
[0027] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细的说明。应当理解的是，此处所描述的
【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0028] 以下实施例中所使用的仪器和试剂均可以通过购买市售产品的方式获得。
[0029] 实施例1
[0030] 1、拟南芥ZFN3蛋白序列获得
[0031] 在北京天一辉远生物技术公司通过全基因合成的方法，合成用于原核表达载体构 建的DNA序列，即合成SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，将SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列 克隆至载体pGM-Τ (购自北京天根生物公司）中，经DNA测序序列正确，将其命名为pGM-ZP 质粒。
[0032] 2、原核表达载体构建：设计一对引物用于构建原核表达载体引物：
[0033] ZP-f :5' -GAACAGATTGGAGGTAACTTGATGGTTTCTGTTCG-3'
[0034] ZP-r :5' -GTGAGACCGGTACCATCAGAATTCGAGTGATGTGGG-3'
[0035] 以pGM-ZP质粒为模板，进行PCR扩增。PCR程序为：95°C变性30s，60°C退火30s， 72°C延伸30s，25个循环。PCR产物经凝胶电泳分析，获得约为250bp的DNA条带（图I)， 产物回收纯化待用。
[0036] 提取原核表达载体pE-SUMOPro质